[發(fā)明專利]一種聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310043855.8
• 申請(qǐng)日: 2013-02-04
• 公開（公告）號(hào): CN103074329A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 婁新徽;張穎;鄒如杏;王文潔
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 首都師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 王旭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是一種類似于DNA天然復(fù)制過程的體外DNA擴(kuò)增的卓越方法。主要由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：即①雙鏈模板DNA經(jīng)高溫變性后解鏈成單鏈；②在DNA聚合酶的作用下，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③DNA模板-引物結(jié)合物，以脫氧核糖核苷酸(dNTP)為原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

PCR技術(shù)所涉及的應(yīng)用研究領(lǐng)域極為廣泛，如疾病診斷、生物多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、基因序列克隆、核酸序列測定、核酸序列體外突變，考古工作等。PCR技術(shù)也是指數(shù)富集的核酸適配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)過程中的重要環(huán)節(jié)。利用SELEX技術(shù)可以從人工合成的隨機(jī)單鏈核酸序列文庫中篩選出能夠與靶分子高特異性、高親和性結(jié)合的核酸適配體(aptamer)。SELEX技術(shù)廣泛適用于各種無機(jī)、有機(jī)小分子，肽，蛋白質(zhì)，糖和抗生素，甚至復(fù)雜細(xì)胞和組織的檢測。尤其，當(dāng)靶分子為HIV-1表面糖蛋白(gp120)，MUC1-多肽(乳腺癌、胃癌等其他癌癥的腫瘤標(biāo)記物)，白血病細(xì)胞(CCRF-CEM)等與重大疾病相關(guān)時(shí)，SELEX技術(shù)將為重大疾病的診療、癌癥的早期診斷提供依據(jù)。

近年來，人們發(fā)現(xiàn)了多種用于提高PCR效率和專一性的添加劑，其中常見添加劑包括：(1)有機(jī)小分子類添加劑，二甲亞砜(Shen，W.H.and?Hohn，B.Trends?Genet.，1992，8，227-227；Jensen，M.A.，F(xiàn)ukushima，M.and?Davis，R.W.Plos?One，2010，5)、甘油(Chakrabarti，R.and?Schutt，C.E.Nucleic?AcidsResearch，2001，29，2377-2381.)、三甲基甘氨酸一水合物(Pinto，A.，Bermudo?Redondo，M.C.，Cengiz?Ozalp，V.and?O′Sullivan，C.K.Mol.Biosyst.，2009，5，548-553.)、甲酰胺(Sarkar，G.，Kapelner，S.and?Sommer，S.S.Nucleic?AcidsRes.，1990，18，7465-7465.)、氯化四甲基銨、7-脫氮-2’-脫氧鳥苷(deaza-dGTP)(Musso，M.，Bocciardi，R.，Parodi，S.，Ravazzolo，R.and?Ceccherini，I.J.Mol.Diagn.，2006，8，544-550)；(2)非離子添加劑，0.1-1％的曲通X-100、吐溫20、諾納德P-40(NP-40)(Li，M.，Lin，Y.C.，Wu，C.C.and?Liu，H.S.Nucleic?AcidsRes.，2005，33.)；(3)蛋白類添加劑，牛血清蛋白(BSA)、T4噬菌體基因32編碼蛋白(一種單鏈DNA結(jié)合蛋白)(Kreader，C.A.Appl.Environ.Microbiol.，1996，62，1102-1106.)等。

然而，已知的增強(qiáng)劑在其適用范圍上都有局限性。例如，二甲亞砜、一水合三甲基氨甘酸可抑制二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，因此適用于鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)含量高(大于等于55％)的模板。而當(dāng)模板的GC含量小于50％時(shí)，這些添加劑對(duì)PCR顯示抑制作用。一些非離子的添加劑可以穩(wěn)定聚合酶，阻止模板DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成，從而增加產(chǎn)物的生成量，但是同時(shí)也造成了非特異擴(kuò)增。最常見的蛋白類增強(qiáng)劑，BSA，在擴(kuò)增傳統(tǒng)DNA模板時(shí)可以提高DNA聚合酶的穩(wěn)定性，減少反應(yīng)物在管壁的吸附，但對(duì)于高GC含量的模板增強(qiáng)效果不佳。因此，迫切需要尋找新的PCR增強(qiáng)劑，可更多地適用于不同模板體系和復(fù)雜環(huán)境背景條件下的擴(kuò)增。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，找到一種普適性增強(qiáng)劑應(yīng)用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體系中，提高PCR的效率和專一性。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種聚合酶鏈反應(yīng)增強(qiáng)方法，其中，使用牛凝血酶蛋白作為添加劑。