[發明專利]一種α-淀粉酶及其基因、含有該基因的工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201310043628.5
• 申請日: 2013-02-04
• 公開（公告）號: CN103103206A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 崔中利;李周坤;黃彥
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/26;C12N15/63;C12N1/21;C12P19/20;C12R1/19
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術領域

本發明屬于應用工業微生物領域，公開了一種α-淀粉及其酶基因、含有該基因的工程菌及其應用。

背景技術

近年來，由于國內外淀粉質原料的深加工業工業的迅猛發展，α-淀粉酶的應用領域不斷地擴大，因此，篩選具有不同特性的α-淀粉酶已成為目前酶制劑研究領域的一個熱點方向。我國是一個農業大國，淀粉質原料深加工業是一個龐大的體系，酶制劑的不斷更新和完善，也為淀粉質原料的深加工提供了良好的條件，同時也為開創新的酶工藝提供了基礎，既提高了效率、降低了消耗，也為節約工業用糧起到至關重要的作用。

淀粉酶是一種十分重要的酶制劑，它占了整個酶制劑市場的25％左右，幾乎完全替代了化合試劑在淀粉工業中的使用。自1833年pαyen從麥芽抽取液中用酒精沉淀出的白色沉淀并成功應用于棉布的退漿以來，α-淀粉酶的研究和應用受到了國內外學者的極大關注，取得了很大進展。目前，已發現的α-淀粉酶分布廣泛，其中主要以微生物來源的淀粉酶用于大規模的發酵生產。α-淀粉酶廣泛的用于糧食加工、食品工業、釀造、發酵、紡織工業和醫藥工業，不僅解決了淀粉質原料的再處理問題還取得了很可觀的經濟效益。

α-淀粉酶可從淀粉分子內部切開α-1,4糖苷鍵，最終生成麥芽寡糖，主要來源于動物，植物，微生物。淀粉酶既作用于直鏈淀粉，亦作用于支鏈淀粉，無差別地隨機切斷糖鏈內部的α-1,4鏈。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急劇下降和碘反應的消失，最終產物在分解直鏈淀粉時以葡萄糖為主，此外，還有少量麥芽三糖及麥芽糖，其中真菌α-淀粉酶水解淀粉的終產物主要以麥芽糖為主且不含大分子極限糊精，在烘焙業和麥芽糖制造業具有廣泛的應用。另一方面在分解支鏈淀粉時，除麥芽糖、葡萄糖、麥芽三糖外，還生成分支部分具有α-1,6鍵的α-極限糊精（又稱α-糊精）。一般分解限度以葡萄糖為準是35-50％，但在細菌的淀粉酶中，亦有呈現高達70％分解限度的（最終游離出葡萄糖）。采用基因工程手段構建高效表達菌株可以實現淀粉酶的大量表達，目前比活最高的淀粉酶約為5000u/mg。淀粉酶基因的獲得在淀粉質原料利用領域有巨大的應用潛力，同時可通過基因改造提高淀粉酶的作用能力，并通過基因工程實現各淀粉水解酶基因的協同作用，以期更好得開發利用淀粉質原料資源，實現生物量的轉化利用，這對人類的可持續發展具有非常重要的意義。

發明內容

本發明的目的在于提供一種新的α-淀粉酶基因，及其編碼的蛋白質。

本發明的另一目的是提供含有該α-淀粉酶基因的基因工程菌。

本發明的又一目的是提供該基因的應用。

α-1,4淀粉酶內切酶基因，其核苷酸序列為：SEQ?ID?NO.1，該基因全長（從起始密碼子到終止密碼子）為1569bp，G+C含量為67％，編碼522個氨基酸。

本發明所述的α-1,4淀粉酶內切酶基因編碼的α-1,4淀粉酶內切酶蛋白質，其氨基酸序列為：SEQ?ID?NO.2。所述的α-1,4淀粉酶最適反應pH為7.0，最適反應溫度為50℃，并在20℃-50℃（1h）和pH5.0-10.0（24h）之間保持活性穩定，同時該酶能在4mol/L的NaCl和KCl中保持活性穩定（15d）。

本發明所述的α-1,4淀粉酶內切酶起始端的23個氨基酸為一典型信號肽，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.4

含本發明所述α-1,4淀粉酶內切酶基因的重組質粒。

所述的重組質粒優選將所述α-1,4淀粉酶內切酶基因克隆到pET-29α(+)中所得。

含本發明所述的重組質粒的重組微生物。

所述的重組微生物，優選以E.coli?BL21(DE3)為宿主菌。

本發明所述α-1,4淀粉酶內切酶基因在淀粉水解方面的基因工程應用。

本發明所述α-1,4淀粉酶內切酶蛋白質在淀粉水解或工業生產方面的應用。

有益效果

1．本發明以從山東東營土樣中篩選出的粘細菌菌株EGB為材料，從該菌的發酵上清中純化出一個高活性α-淀粉酶，通過蛋白質氨基酸測序結合PCR擴增，成功獲得α-1,4淀粉酶內切酶基因序列，該酶對以可溶性淀粉為底物測活時，酶活高達10013u/mg。

2.該基因全長（從起始密碼子到終止密碼子）為1569bp，G+C含量為67％，編碼522個氨基酸。