[發明專利]一種重組牛源性胰蛋白酶的制備方法

有效

• 申請號: 201310043541.8
• 申請日: 2013-02-04
• 公開（公告）號: CN103966191A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 王雪;彭毅;唐耀旺;王大梅;郭云亮;趙淑紅;楊青
• 申請（專利權）人: 甘李藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76;C12N15/57;C12N15/63;C12N15/70
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1.一種重組牛源性胰蛋白酶原類似物，其序列結構從N端到C端依次包括A1-A2-A3，其中A1序列由1-4個氨基酸組成，所述氨基酸選自A、F、P、V、D、S或K，A2序列為TRY酶切位點序列，A3序列為具有牛源性胰蛋白酶活性的蛋白質序列。

2.根據權利要求1所述的重組牛源性胰蛋白酶原類似物，其中所述A1序列選自AFPV、V、S或AFPS。

3.根據權利要求1所述的重組牛源性胰蛋白酶原類似物，其中所述A2序列為DDDDK。

4.根據權利要求1-3任一項所述的重組牛源性胰蛋白酶原類似物，其結構包含選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

5.編碼權利要求1-4任一項所述的重組牛源性胰蛋白酶原類似物的核苷酸序列。

6.根據權利要求5所述的核苷酸序列，包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。

7.一種表達載體，包含權利要求5或6所述的核苷酸序列。

8.一種重組牛源性胰蛋白酶的制備方法，該方法是以大腸桿菌作為表達宿主的包涵體表達方法，包括以下步驟：

1）通過引物對編碼胰蛋白酶酶原的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列進行PCR擴增；

2）將擴增后的產物與質粒整合得到重組胰蛋白酶酶原表達載體，其中所述重組胰蛋白酶酶原表達載體載有的核苷酸序列為權利要求5-7任一項所述的核苷酸序列；

3）將上述載體轉化至大腸桿菌宿主；

4）誘導上述大腸桿菌宿主表達胰蛋白酶酶原包涵體；

5）將上述包涵體變性復性得到胰蛋白酶酶原；

6）純化上述胰蛋白酶酶原；

7）酶切上述純化后的胰蛋白酶酶原，生成胰蛋白酶；

8）純化上述胰蛋白酶。

9.一種重組牛源性胰蛋白酶的制備方法，該方法是以大腸桿菌作為表達宿主的可溶性表達方法，包括以下步驟：

1）通過引物對編碼胰蛋白酶酶原的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列進行PCR擴增；

2）將擴增后的產物與質粒整合得到重組胰蛋白酶酶原表達載體，其中所述重組胰蛋白酶酶原表達載體載有的核苷酸序列為權利要求5-7任一項所述的核苷酸序列；

3）將上述載體轉化至大腸桿菌宿主；

4）誘導上述大腸桿菌宿主表達胰蛋白酶酶原；

5）純化上述胰蛋白酶酶原；

6）酶切上述純化后的胰蛋白酶酶原，生成胰蛋白酶；

7）純化上述胰蛋白酶。

10.根據權利要求9所述的制備方法，其中，步驟2）所述質粒選自pET28a、pBV220、pQE30、pET32a、pNJUTRX-1、pET21其中之一；或

步驟3）所述大腸桿菌宿主選自DH5α、HB101、JM109、TOP10、BL21、M110、SCS110其中之一；或

步驟4）所述誘導表達是使用濃度為0.1mM至10mM的IPTG( 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)在15℃至37℃溫度下進行的；或

步驟5）所述的純化是采用Ni²⁺-NTA基質進行，采用梯度為20mM至250mM的咪唑溶液或pH梯度進行洗脫。