[發明專利]利用間歇浸沒生物反應器進行金線蓮組織培養擴繁方法

無效

• 申請號: 201310043181.1
• 申請日: 2013-02-04
• 公開（公告）號: CN103120126A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發明（設計）人: 陳集雙;張本厚;賈明良;金磊磊
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京正聯知識產權代理有限公司 32243
• 代理人: 王素琴

技術領域

本發明屬于藥用植物組織培養技術領域，具體涉及一種利用間歇浸沒生物反應器進行金線蓮組織培養快速繁殖，從而獲得優質種苗的方法。

背景技術

金線蓮（Anoecthilus?roxburghii）為蘭科開唇蘭屬多年生草本植物，別名為金線蘭、金絲草、樹草蓮、金線虎頭蕉等。通常生長在蔭蔽闊葉林下的肥沃腐葉土中，是我國傳統的珍貴藥材，有清涼解毒、滋陰降火、消炎止痛的功效，且無毒副作用，在民間素有“藥王”的美譽。金線蓮株高8~20cm，株型小巧，葉型優美，葉脈金黃色、呈網狀排列，又是觀賞價值極高的室內觀葉珍品。金線蓮種子微小，胚發育不完全，在自然條件下極難出芽；若以分根或扦插繁殖，則耗時長且繁殖系數低，金線蓮賴以生存的自然環境發生變化，野生資源銳減，加之長期采挖，種質資源稀缺，已瀕臨滅絕，已不能滿足臨床需求。野生金線蓮干貨最高曾漲到每公斤3000多元。

應用植物組培快繁方法在一定程度上解決了金線蓮種苗短缺的現象，有關金線蓮的快速繁殖技術國內多有報道。但是，應用植物組培的方法生產金線蓮種苗，消耗大量的人力、物力，生產成本居高不下，且培養周期長，種苗質量不高，仍不能滿足藥農的需求。

利用間歇浸沒培養反應器成功進行其它植物培養的研究已有報道。在中國專利文獻CN101720668B中，公開了一種利用間歇浸沒式間歇浸沒培養系統進行甘蔗組織培養快繁的方法，其利用間歇浸沒培養反應器對三個品種的甘蔗培養進行了介紹。在中國專利文獻CN101213942A中披露了一種藥用金線蓮組織培養一步成苗快速繁殖方法，但是培養時間過長，效率低下。

一方面由于不同間歇浸沒培養裝置的操作方法不同，上述專利文獻中所使用的培養裝置和本專利不同；另一方面由于各種植物生理、生化上的不同，相同的培養方法對不同的植物培養不一樣，需要不同的培養條件和處理方式，并不能通過簡單的有限次實驗推理來得到。上述文獻專利中提及的步驟以及其中涉及到的具體的培養方式和培養條件完全不能用于利用間歇浸沒生物反應器培育金線蓮。

應用間歇浸沒生物反應器進行金線蓮種苗的生產可以彌補傳統方法生產的缺陷，為低成本的生產高質量的金線蓮種苗提供了有效的方法。

鑒于利用間歇浸沒式培養方法進行金線蓮種苗的生產未見報道和公開應用，因此，有必要研究出一種利用間歇浸沒生物反應器進行金線蓮組織培養快速繁殖的方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種周期短、成本低、操作簡單的金線蓮種苗生產方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：利用間歇浸沒生物反應器進行金線蓮組織培養快繁的方法包括準備工作、外植體選擇與無菌處理、接種、生物反應器培養，具體地，該方法包括以下步驟：

（1）前期準備

培養液配制：?MS液體為基本培養液，添加激素NAA0.2~1.5mg/L；激素6-BA?0.5~2.5mg/L；蔗糖濃度30g/L；金線蓮0.1~1.0g/L；培養液配制完成后，放入三角瓶中，高溫高壓濕熱滅菌后備用；

反應器滅菌：將反應器包扎，高溫高壓濕熱滅菌后備用；

（2）外植體選擇與無菌處理

當外植體為自然生長的植株時，需要對莖無菌處理；

當外植體為無菌組培苗時，直接進行接種；

（3）接種

?????無菌環境中，將已滅菌的培養液倒入已滅菌的反應器中；

當外植體為自然生長的植株時，將無菌處理過的莖除去葉片后切成每個含一個莖節的若干莖段，首先接種到MS固體培養基中，經過3~5天的觀察培養，無菌后接種到上述反應器中；

當外植體為無菌組培苗時，除去葉片同樣將莖切成每個含一個莖節的若干莖段，直接接種到上述反應器中；

反應器接種密度35~80個莖段/L；

（4）生物反應器培養

設定間歇浸沒反應器的參數：浸沒頻率：3~15min/6~12h，優選5~10?min/8~10h；培養時間為60~120d。

設定培養環境條件為：光照強度1500~1800lux，光照12?h/d，溫度25±1℃。

作為本發明進一步的改進在于，所述步驟（1）前期準備中，所述激素NAA0.5~1.0mg/L，激素6-BA?1.0~1.5?mg/L，金線蓮0.2~0.5?g/L，調整PH值5.8~6.2；所述步驟（3）接種中，反應器接種密度45~60個莖段/L；所述步驟（4）生物反應器培養中的培養時間為80~90d。