[發(fā)明專利]采用PCR引物等溫?cái)U(kuò)增核酸片段的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310042936.6
• 申請日: 2013-02-04
• 公開（公告）號: CN103333882A
• 公開（公告）日: 2013-10-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王德國
• 申請（專利權(quán)）人: 王德國
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 鄭州科維專利代理有限公司 41102
• 代理人: 辛國瑞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種等溫?cái)U(kuò)增核酸片段的方法，特別是用與靶序列兩個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的一對PCR引物通過鏈替代反應(yīng)擴(kuò)增核酸片段，該方法可作為特異基因片段的快速擴(kuò)增檢測手段。?

背景技術(shù)

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子技術(shù)的發(fā)展，研究開發(fā)了許多核酸擴(kuò)增技術(shù)。其中核酸環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（專利ZL?00818262.0，ZL01810370.7，ZL01812204.3，ZL02815992.6，ZL200610080379.7），由于其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、反應(yīng)速度快的特點(diǎn)，在核酸特異性擴(kuò)增和檢測領(lǐng)域具有取代PCR的趨勢，成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。核酸環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的主要原理是基于對靶序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)2對特異引物，利用一種鏈置換?DNA?聚合酶（Bst?DNA?polymerase），在65℃左右的等溫條件下保溫約60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，存在環(huán)引物的情況下，擴(kuò)增時(shí)間可進(jìn)一步縮短為40分鐘，同時(shí)具備不需要熱循環(huán)、擴(kuò)增效率更高、不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)。?

然而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)需要針對核酸片段的6-8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)引物，其中至少核酸片段的6個(gè)區(qū)域（F3_C、F2_C、F1、B1、B2_C和B3_C）與2對引物（實(shí)質(zhì)是3對引物：F3，F(xiàn)1_C-F2、B1_C-B2、B3）完全匹配才能進(jìn)行擴(kuò)增，如果加上環(huán)引物（LF、LB），需要設(shè)計(jì)4對引物，引物二聚體的產(chǎn)生很難避免，引物二聚體引起的假陽性問題也很難避免，限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供一種用PCR引物等溫?cái)U(kuò)增核酸片段的方法，該方法可作為特異基因片段的快速擴(kuò)增檢測手段。

上述目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：?

一對PCR引物，其特征在于，針對核酸片段，采用PrimerPremier5.0等引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)上游引物F和下游引物R。

等溫?cái)U(kuò)增過程，其特征在于，DNA?在?65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一條引物向雙鏈?DNA?的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對延伸時(shí)，另一條鏈就會解離，變成單鏈，本發(fā)明的整個(gè)反應(yīng)過程分為初始模板合成階段和循環(huán)擴(kuò)增階段，如附圖1。初始模板合成階段：在?65℃左右DNA處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)上游引物F和下游引物R分別在雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對延伸時(shí)，DNA雙鏈解開，上游引物F和下游引物R分別引導(dǎo)合成互補(bǔ)的DNA鏈，如附圖1（1）、1（2）、1（3）和1（4）；合成的靶序列DNA1可作為循環(huán)擴(kuò)增階段的初始模板，如附圖1（5）和1（10）。循環(huán)擴(kuò)增階段：在初始模板合成階段被替代下來的DNA1單鏈F1和R1可作為循環(huán)擴(kuò)增階段的引物，如附圖1（5），分別引導(dǎo)合成DNA2，其長度對靶序列的2倍，如附圖1（6）、1（7）、1（8）和1（9）。同理，合成的DNA1、DNA2、DNA3…DNAn均可作為循環(huán)擴(kuò)增階段的模板，被替代下來的單鏈F1、F2、F3…Fn和R1、R2、R3…Rn均可作為循環(huán)擴(kuò)增階段的引物，終產(chǎn)物為大小不一的片段，其長度分別為靶序列的整數(shù)倍，如圖1，在電泳圖譜上為梯度條帶。?

催化等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的酶，其特征在于，本發(fā)明中催化該擴(kuò)增反應(yīng)的酶為Bca（exo-）DNA聚合酶，或Bst?DNA聚合酶，或Bca（exo-）DNA聚合酶與Tag?DNA聚合酶的混合物，或Bst?DNA聚合酶與Tag?DNA聚合酶的混合物，或其他具有相似作用的酶或酶的混合物。?

模板，其特征在于，核酸片段為DNA或mRNA，核酸片段為mRNA時(shí)，先使用逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。?

本發(fā)明的有益的積極效果：?

1．本發(fā)明所提出的一對引物等溫?cái)U(kuò)增核酸片段的方法，可作為特異基因片段的快速擴(kuò)增檢測手段。

2.?本發(fā)明所提出的等溫?cái)U(kuò)增核酸片段的方法具有下列各項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)：?

（1）靈敏度高，該等溫?cái)U(kuò)增方法能在模板DNA純度很低的情況下進(jìn)行擴(kuò)增，很少受培養(yǎng)介質(zhì)和生物學(xué)物質(zhì)的影響，純化步驟可以忽略。

（2）速度快，該方法是等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，沒有?PCR反應(yīng)中溫度變化的耗時(shí)，在20min～60min內(nèi)即可完成反應(yīng)過程。?

（3）易推廣，該反應(yīng)是一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增過程，不用控制溫度的變化，所以只需一個(gè)簡單的等溫器，不需要昂貴的?PCR儀，對操作人員的分子生物學(xué)技術(shù)要求不高。?