[發明專利]一種復合轉氨酶校準物質的制備方法

無效

• 申請號: 201310042806.2
• 申請日: 2013-01-31
• 公開（公告）號: CN103224974A
• 公開（公告）日: 2013-07-31
• 發明（設計）人: 胡衛江;夏勇;李海龍;歐文斌;蔣哲;顧蘭蘭;孟凡國
• 申請（專利權）人: 浙江清華長三角研究院;嘉興博泰生物科技發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/52
• 分類號: C12Q1/52
• 代理公司: 杭州九洲專利事務所有限公司 33101
• 代理人: 翁霽明

1.一種復合轉氨酶校準物質的制備方法，其特征在于該制備方法包括如下步驟：

1）．高純度酶原料的制備、純化及測定，

以已克隆的ALT、AST基因表達載體表達至大腸桿菌的工程菌后，以ALT、AST的粗酶原料，經硫酸銨分級鹽析，透析，柱層析等步驟，得到高純度的ALT和AST純品；

以純化的ALT和AST為樣品，用常規的生物化學方法測定血清中常見的其他酶含量，確保純化的兩種轉氨酶中，基本無其他雜酶存在，對ALT與AST的活力測定無影響；

2）．基質物質的制備與分析，包括如下：

2.1基礎性血清基質物質制備，

（1）以正常人血清為原料，選擇健康獻血志愿者樣本，篩選并收集經過通過艾滋、梅毒、乙肝、丙肝指標的檢測符合要求的血清樣本，選擇轉氨酶在正常值范圍內的樣本，作為基質物質制備的原料；

（2）將已經篩選的血清進行：穩定性維持---去顆粒---去脂---去濁等幾個步驟確定為基礎性血清基質物質A；

2.2基質物質A的成分分析：用全自動生化分析儀對基礎性血清基質物質A進行分析；

2.3根據分析結果對重要的組成成分濃度進行調節，其中主要為蛋白質濃度，以及離子濃度，盡量做到與正常血清一致才可，得到血清類似物B；其中目標酶濃度為正常酶濃度的2-3倍左右；

2.4滲透壓調節：以滲透壓調節劑調節血清類似物B的滲透壓，使其成為等滲溶液，得到與血清滲透壓相同的基質物質C；

2.5適量ALT,AST穩定劑：根據ALT、AST的反應性質以及影響因素，加入兩種酶的不同濃度的穩定劑，確定為候選校準物質D、E；

2.6候選校準物穩定性和互通性分析：根據以上結果確定不同的基質物質，并添加為終濃度為80IU/L左右的AST、ALT混合物作為校準物質的候選物F、G；選擇穩定性及互通性均符合要求的為最終的轉氨酶復合校準物質。

2.根據權利要求1所述的復合轉氨酶校準物質的制備方法，其特征在于步驟1）中，以基因重組的人丙氨酸氨基轉移酶作為丙氨酸氨基轉移酶標準物質研制的原料，基因表達載體為pReceiver-ALT。酶切及測序證明與預期結果一致后進行體外表達；將表達載體轉至BL21菌種中，于含氨芐青霉素的LB液體培養基中培養，適時加入IPTG誘導表達，至終濃度至0.25mmol/L，于16℃進行表達，收集菌體；超聲破碎后取上清；將超聲破碎后的上清經過30%及50%硫酸銨沉淀進行分級分離；再將50%硫酸銨沉淀進行透析；將透析后的粗酶用鎳離子金屬鰲合親和層析柱(Ni-NTA)進行純化，得到電泳純的ALT；

以基因重組的人天冬氨酸氨基轉移酶作為天冬氨酸氨基轉移酶標準物質研制的原料，基因表達載體為pReceiver-AST；酶切及測序證明與預期結果一致后進行體外表達；將表達載體轉至BL21菌種中，于含氨芐青霉素的LB液體培養基中培養，適時加入IPTG誘導表達，至終濃度至0.25mmol/L，于16℃進行表達，收集菌體；超聲破碎后高速離心取上清；將超聲破碎后的上清經過0.45μm的濾膜過濾后，用鎳離子金屬鰲合親和層析柱(Ni-NTA)進行純化，得到電泳純的AST。

3.根據權利要求1所述的復合轉氨酶校準物質的制備方法，其特征在于步驟2）中的（2），將已經篩選的血清進行如下幾個分步驟，然后確定為基礎性血清基質物質A：

1）將收集的血清在-80℃～4℃～37℃之間反復凍融2-4次；

2）凍融處理后的血清4000～8000rpm，離心15min，棄掉沉淀；

3）將離心后的血清物質經過粗濾、精濾兩次過濾后，作為候選血清基質，并將該基質物質與原血清進行比對分析。