[發明專利]玉米抗除草劑蛋白及其在植物育種中的應用

有效

• 申請號: 201310042383.4
• 申請日: 2013-02-01
• 公開（公告）號: CN103103176A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 黃拔嚴;石久英
• 申請（專利權）人: 北京興博雅生物技術有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12Q1/68;A01H5/00;A01H1/02;G01N33/68
• 代理公司: 北京清亦華知識產權代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術領域

本發明屬于植物蛋白質領域，具體而言，本發明涉及能賦予植物（尤其是玉米）除草劑抗性（耐受性）的蛋白及其在植物育種中的應用。

背景技術

農田中雜草是影響農作物產量的最重要因素之一，而人工除草所需要消耗的人力資源和成本很高，而且不便于農業集約化生產，嚴重制約了農作物種植向高產、優質和低成本方向的發展進程。因此，除草劑就運應而生，其使用為解決農田草害、促進栽培方式的革新及增產中起了很大的作用。

常見的除草劑，包括有磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶并三唑類、水楊酸嘧啶類等除草劑，目前已經大面積商業推廣使用。然而，由于這些除草劑通常也能殺死農作物本身，因此對一般不具有除草劑抗性（耐受性）的農作物而言，除草劑的使用在時間和空間上受到了極大限制，如需要在農作物播種前一段時間使用除草劑。

為此，人們研究開發具有除草劑抗性（耐受性）的植物（農作物），這樣可以在種植期間使用除草劑，殺死雜草，但不影響植物本身的生長，由此拓寬了除草劑的使用范圍。盡管當前有不少文獻報道在某些基因上進行突變再導入野生型植物成為轉基因植物，可以給植物帶來除草劑抗性，但是實驗多針對擬南芥等遺傳背景比較清楚的模式植物，但是對于實際種植的農作物，尤其是經過大量前期轉基因和/或非轉基因育種獲得的具有良好性狀（同時遺傳背景復雜）的農作物來說，往往情況很不樂觀，如我們發現，在體外和/或擬南芥導入測試具有除草劑抗性的突變基因，導入玉米等后卻發生大量發生了回復喪失除草劑抗性的情況，有些雖然保留了除草劑抗性，但是玉米生長發育不正常而根本無法實踐中應用，這很可能是由于玉米中大量基因協同作用的結果。所以，對于復雜遺傳背景的植物（如玉米，尤其是改良過的玉米），具有除草劑抗性的植物及其真實能起決定性的物質（如蛋白、基因等）目前還沒有理論來定向設計出，只能依賴于科研人員艱苦實踐而獲得，尤其是依賴長期篩選，并且憑借一些運氣才能獲得。

本發明人正是長期而艱苦的研究實踐，憑借運氣偶然地在玉米自交系京21突變植株中發現了一系列（突變）蛋白，其能夠在除草劑存在的條件下基本保持原有蛋白的正常植物生理功能，從而使得玉米（尤其是京21）具有除草劑抗性（耐受性）。本發明人還開發了這些蛋白及其編碼基因在轉基因或者非轉基因植物育種中的應用，可用于培育具有除草劑抗性的植物，尤其是農作物，如玉米等。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于提供新的使植物具有除草劑抗性的蛋白質。另外，本發明還提供了編碼這些蛋白質的核酸以及基因工程中間體（如，表達盒、載體和細胞等），獲得具有除草劑抗性的植物的方法和應用，并且提供了判斷植物是否采用本發明方法獲得的鑒定方法。

具體而言，在第一方面，本發明提供了ALS突變蛋白質，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2或4所示。該蛋白質能使植物（如玉米，尤其是京21）具有除草劑抗性。在本文中，ALS就是乙酰乳酸合成酶（acetolactate?synthase）的簡稱，其酶分類編號為EC4,1.3.18。乙酰乳酸合成酶是支鏈氨基酸合成中的一個關鍵酶，如在纈氨酸和亮氨酸的合成中催化丙酮酸生成乙酰乳酸和二氧化碳，在異亮氨酸的合成中催化丙酮酸與丁酮酸生成2-乙醛基-2-羥基丁酸。

本發明第一方面的蛋白質是經過大量篩選從本發明人突變的玉米植株（如，京21）中發現的，能使相應植株具有除草劑抗性。目前，還沒有報道表明，在來自玉米的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2或4所示的突變蛋白，會使得相應植物（尤其是玉米）具有除草劑抗性，更無法預測在保持除草劑抗性的同時，還能保持正常的生長情況。在本文中，京21，又稱京21號，是由中國農業科學院作物科學研究所玉米研究中心開發的玉米自交品系，其具有株型緊湊、抗病性好、抗倒伏以及配合力強等性狀特點。本發明人發現該品系可以在高濃度咪草煙的種子浸泡實驗中被篩選出抗咪草煙突變植株。公眾可以通過商業渠道獲取京21，例如可以從中國農業科學院作物科學研究所玉米研究中心購買。

除了本發明具體實施方式所述的突變植株篩選和擴增方法之外，在蛋白質序列已知的情況下，本領域技術人員有能力通過改變已知蛋白質的編碼基因序列并將其導入表達載體，就可以制備出取代、添加或缺失了氨基酸殘基的蛋白質，這些方法記載于《分子克隆實驗指南》（北京：科學出版社，2002年）等文獻中。通過轉基因技術，編碼這些蛋白質的基因可以導入植物中，優選導入玉米中，例如導入（野生型）京21中，從而賦予植物抗除草劑性能。