[發明專利]一種用于高通量分型檢測人乳頭瘤病毒的基因芯片、試劑及其試劑盒

有效

• 申請號: 201310041615.4
• 申請日: 2013-02-01
• 公開（公告）號: CN103409553A
• 公開（公告）日: 2013-11-27
• 發明（設計）人: 黃明輝;黃鶴;李勐;趙雷
• 申請（專利權）人: 港龍生物技術（深圳）有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C40B40/06
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所(普通合伙) 44248
• 代理人: 胡吉科;孫偉

技術領域

本發明技術領域涉及一種基因芯片技術；尤其是涉及一種檢測人乳頭瘤病毒（HPV）DNA的基因芯片及其試劑,還涉及一種利用本方法檢測樣本中HPV?DNA各種型別的試劑盒。

背景技術

人乳頭瘤病毒（HPV）是一類感染人類上皮細胞DNA病毒，根據HPV基因組E6、E7和L1區開放閱讀框核苷酸序列同源性不超過90%的定義，已發現100多種HPV型，一些型別根據上述區域同源性在90%-98%且不超過98%的定義，還可進一步分為不同的亞型。

HPV可以引起人全身各部位的皮膚或者粘膜感染，導致多種上皮組織疾病，例如皮膚尋常疣，扁平疣，外生殖器的尖銳濕疣等。宮頸上皮組織長期感染的某些型別的HPV可能引起基因突變，導致感染部位發生癌變。沒有HPV感染不可能導致宮頸癌，而有HPV感染不一定會導致疾病和宮頸癌。因為HPV感染大多數是一過性感染，即在感染后短期內靠自身免疫力轉歸，不會導致疾病，只有少數轉為持續性感染，而且也可能存在反復性的感染，據統計，80%的女性一生有可能至少感染HPV一次。能夠感染人類的泌尿生殖道的40多種HPV型別中，按照導致宮頸癌風險的高低將HPV分為高危型和低危型，高危型HPV可能導致婦女發生宮頸癌，主要包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82等型別，低危性HPV主要引起尖銳濕疣，包括HPV6、11、40、42、43、44、54、55、57、61、71、81、83等型別。

由于HPV目前還不能進行體外培養，免疫學的抗體檢測方法缺乏可靠一致的結果，HPV的檢測主要依賴于細胞學和分子生物學的基因檢測方法。細胞學檢測方法在檢查時發現感染HPV只能是引起細胞病變之后，而HPV的DNA檢測，可以在細胞學異常出現之前發現HPV的存在，從而進行預防，減少發生疾病的風險。目前分子生物學檢測HPV?DNA的方法主要有：（1）以抗體捕獲、核酸雜交和化學發光信號放大技術為基礎的第二代雜交捕獲（HCII）法；（2）以PCR技術為基礎的檢測方法。由于PCR技術的高靈敏性，后者的檢測靈敏度高于前者。由于HPV各型之間的基因存在較大的變異，多數研究者采用位于HPV基因組相對保守的L1片斷的簡并引物擴增后，PCR產物經過電泳、雜交等檢測方法確定HPV的存在。目前常用的簡并引物包括GP5/GP6,MY11/MY09,SPF，PGMY11/PGMY09等等。上述引物在擴增HPV時，具有不同的HPV型擴增譜和不同的靈敏度。目前基于PCR對多種型別HPV的檢測方法常用的反向點雜交法，在一張較大的膜條（幾個厘米至十多厘米）或其他基質上附著HPV檢測的DNA探針，存在膜條載體面積大、雜交體積大、雜交時間長、需要使用旋轉雜交儀、操作復雜等缺點，這種方法不屬于基因芯片的范疇，無法做到對更多型別的多指標大樣本量進行平行的高通量的快檢測。

生物芯片（biochip或bioarray）是采用能夠并行處理生物樣本中的多個信息的微處理單元形成的集合體，根據生物分子間特異相互作用的原理，將生物分子分析過程集成于芯片表面，從而實現對DNA、RNA、多肽、蛋白質以及其他生物成分的高通量快速檢測。狹義的生物芯片概念是指通過不同方法將生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic?DNA、多肽、抗體、抗原等）固著于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝膠、尼龍膜等固相遞質上形成的生物分子點陣。基因芯片和DNA微陣列技術是生物芯片的一個種類，采用以陣列方式設定在平面基質載體上形成能夠并行處理生物樣本中多個基因信息的微處理單元，它具有微型化和并行處理的特征，點陣排布點直徑在500μm以內，相鄰兩個點的中心點間距在1000μm以內，點陣列用于檢測基因分子。利用基因芯片技術可以實現多指標大樣本進行各種基因的高通量分析。

發明內容

本發明的目的在于結合核酸擴增、DNA分子雜交、信號放大技術和基因芯片技術形成一種高通量檢測多種HPV型別的新方法和試劑盒。在HPV基因L1區設計簡并引物進行PCR擴增樣本中的HPV?DNA片段；設計特異性核酸探針，通過基因芯片點樣儀，將各種探針點樣在平面載體上很小面積上形成基因芯片微陣列；將擴增的PCR產物與探針在特指的微孔板裝置承載的孔內（利用微孔板的48或96孔作為反應池）進行分子雜交，通過信號放大，經基因芯片閱讀分析儀檢測芯片給出的信號，可以檢測多種HPV型（包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、53、66、67、69、73、82、6、11、40、42、43、44、54、55、57），達到快速靈敏和高通量的檢測效果。