[發(fā)明專利]登革2型病毒納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及核苷酸序列

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310041412.5
• 申請(qǐng)日: 2013-02-01
• 公開（公告）號(hào): CN103103293A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉翌;孫寧;王飛;周小平;楊秀娟;孫福軍;鄧叢良;葛廣路;秦成峰;陸琳;汪琳;張紹福;柏亞鐸
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中華人民共和國(guó)北京出入境檢驗(yàn)檢疫局
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 王來(lái)佳

1.一種登革2型病毒納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于：試劑盒含有Fe₃O₄納米磁性微粒，用于分離提取登革2型病毒RNA，所述的Fe₃O₄納米磁性微粒為表面硅羥基改性的Fe₃O₄納米粒子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革2型病毒納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述Fe₃O₄納米磁微粒分離提取登革2型病毒RNA的步驟如下：

⑴取10μl納米磁微粒MNP（25μg/μl）溶液，用磁鐵吸附MNP，棄上清；加入裂解液250μl，將MNP吹打混勻，加入登革熱疑似病人血漿或血清標(biāo)本50μl，混勻，60℃5min，室溫靜置2min；

⑵加入300μl結(jié)合液，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置10min，用磁鐵吸附MNP，棄上清；

⑶加入洗液清洗MNP，用磁鐵吸附MNP，棄上清；重復(fù)清洗一次；3000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；

⑷加入洗脫液50μl，將MNP吹打混勻，65℃5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革2型病毒納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述Fe₃O₄納米磁微粒的制備方法為：利用熱分解法分解乙酰丙酮鐵，合成Fe₃O₄納米粒子，在堿性條件下水解四乙氧基硅烷，包裹Fe₃O₄納米粒子，形成表面為硅羥基的納米磁性微粒。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的登革2型病毒納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括如下組分：納米磁微粒、裂解液、結(jié)合液、洗液、洗脫液、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照；

所述結(jié)合液為無(wú)水乙醇；

所述洗液為70%乙醇；

所述洗脫液為TE?pH8.0；

所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括下游引物R1，見序列2；

所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液包括上游引物F1，見序列1，下游引物R1，見序列2和熒光探針P1，見序列3；

所述的陽(yáng)性對(duì)照為登革2型病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；

所述的陰性對(duì)照為滅活的正常人陰性血清。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的登革2型病毒納米磁分離實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述熒光探針的5′端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA,或其他配對(duì)的熒光標(biāo)記均可。

6.一組登革2型病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的核苷酸序列，其特征在于：其核苷酸序列為序列1、序列2、序列3，其中序列1為上游引物、序列2為下游引物、序列3為熒光探針。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的登革2型病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的核苷酸序列，其特征在于：所述熒光探針的5′端標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)TAMRA，或其他配對(duì)的熒光標(biāo)記均可。

8.一種登革2型病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于：含有一組如權(quán)利要求6所述的核苷酸序列。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的登革2型病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于：由以下組成：裂解液、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。

所述的陽(yáng)性對(duì)照為質(zhì)粒濃度為1×10⁶copies/μl的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；

所述的陰性對(duì)照為滅活的正常人陰性血清；

所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括下游引物R1，見序列2；

所述實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)液包括上游引物F1見序列1，下游引物R1見序列2和熒光探針P1，見序列3；

所述的陽(yáng)性對(duì)照為質(zhì)粒濃度為登革2型病毒質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；

所述的陰性對(duì)照為滅活的正常人陰性血清。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的登革2型病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于：上游引物、下游引物、熒光探針的濃度為：上游引物200nM，下游引物200nM，熒光探針120nM。