[發明專利]一種基因組多拷貝基因拷貝數的快速批量測定方法

無效

• 申請號: 201310041295.2
• 申請日: 2013-02-01
• 公開（公告）號: CN103103280A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 沈林園;朱礪;李雪梅;沈靜;張順華;李學偉;李學杰;高菲;蔣小兵;鄭夢月
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及一種基因測定方法，尤其涉及一種利用PCR技術和RT-PCR技術對基因組多拷貝基因拷貝數的快速批量測定方法。

背景技術：

拷貝數目變異(copy-number?variant，CNV)也稱拷貝數目多態(copy-number?polymorphism，CNP)，是一種大小介于1kb至3Mb的DNA片段的變異，在人類基因組中廣泛分布，其覆蓋的核苷酸總數大大超過單核苷酸多態性(single?nucleotide?polymorphisms，SNPs)的總數，極大地豐富了基因組遺傳變異的多樣性，CNV對于物種特異的基因組構成、物種的演化和系統發育以及基因組某些特定區域基因的表達和調控可能具有非常重要的生物學意義，已有研究發現，CNV發生的頻率遠遠高于染色體結構變異，而且在整個基因組中覆蓋的核苷酸總數大大超過SNP的總數，由此，研究者們認為，CNV可能和表型變異緊密關聯，同時在物種的演化和發展中發揮著重要作用，同時，研究者們還認為此類變異是基因組中最主要的變異，是導致個體間表型差異及各種遺傳性疾病和疾病易感性的主要原因，如自閉癥(autism)，精神分裂癥(schizophrenia)和克羅恩病(Crohn′s?disease)的致病機理就是因為正常的多拷貝基因拷貝數突然改變，導致疾病的發生，所以對生物體多拷貝基因拷貝數的快速、準確測定可以對人類某些疾病的診斷和治療提供生物學方法以及對生命科學中相關現象的生理機制研究提供科學手段。

現行測定基因拷貝數的方法主要有：1、基因組測序法：是通過多種測序方法對整個基因組的所有基因序列進行測定，將得到的序列與目的基因序列進行比對分析，從而得到目的基因的拷貝數；2、基因芯片技術：就是通過微陣列技術，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的基因探針有規律地排列固定于2cm²的硅片、玻片等支持物上，構成一個二維DNA探針陣列，當溶液中帶有熒光標記的核酸序列與基因芯片上對應位置的核酸探針產生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列，據此可重組出目標基因的拷貝數；3、DNA復性動力學法：是指DNA經熱變性，再恢復(重新復性)過程的動力學分析，按DNA復性速度的快慢，將真核生物的DNA分為單一順序、中度重復順序和高度重復順序三類不同的基因組織，從而得到目的基因的拷貝數；4、生物雜交法：將轉基因動植物個體和非轉基因動植物個體相互雜交，根據子代中轉基因動植物個體的數量和孟德爾定律，推算出目標基因在轉基因動植物個體中的拷貝數；5、Southern印跡法：將轉基因個體的DNA用限制性內切酶水解，然后用瓊脂糖凝膠電泳將DNA按片段大小分開，再將其轉移到硝酸纖維或尼龍膜上，將目標基因用放射性同位素或其他方法標記，然后和印到膜上的DNA雜交，根據放射性條帶的數值，推斷出目標基因的拷貝數；6、熒光定量法：實時PCR又稱TapMan?PCR，它用一對基因的PCR引物和探針以及DNA聚合酶，通過反復的熱冷循環，使目標基因以指數形式擴增，由于PCR產物可以用熒光信號來定量，而且熒光閾值循環數(Ct)與被擴增基因的起始濃度對數是直線負相關的，因此可以用目標基因和已知內參基因來確定目標基因的拷貝數。