[發明專利]一種鳥蛤科貝類線粒體16S rRNA基因的擴增引物

無效

• 申請號: 201310040813.9
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103103186A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 李琪;于貞貞;孔令鋒
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種鳥蛤貝類線粒體16S?rRNA[16S核糖體RNA(16small-subunit?ribosomal?RNA)]基因擴增引物。?

背景技術

鳥蛤科(Cardiidae)隸屬于雙殼綱(Bivalvia)，異齒亞綱(Heterodonta)，簾蛤目(Veneroida)。鳥蛤科貝類物種豐富、大小不一，全世界約250種，我國發現的約50種，小的直徑約1公分，大的直徑能達到15公分(如加利福尼亞的光滑巨鳥蛤)。鳥蛤為世界性分布，常棲息在印度洋-西太平洋海域的淺海中，在新加坡、日本、澳大利亞、馬來西亞、印度尼西亞、中國大陸、臺灣及南海諸島等地均有分布。鳥蛤科貝類包含滑頂薄殼鳥蛤、加州扁鳥蛤、黃邊糙鳥蛤、中華鳥蛤等在水產養殖及捕撈上具有重要價值的種類，是一個具有很高的經濟價值的大類群。傳統的分類主要是依據殼的形狀，殼表的顏色，放射肋的數目、二級結構和肋間溝的寬窄來區分鳥蛤科不同物種，例如，單色糙鳥蛤和砂糙鳥蛤其形態學區別為前者較大，放射肋約46條，而后者較小，約有45條放射肋。這些形態學鑒定指標不穩定、可塑性強、可明確的量化特征少，對專業要求很高且帶有很強的主觀傾向性，單靠形態學特征極易導致錯誤的鑒定。而且鳥蛤科含有大量近緣種，近緣種之間的形態學差異細微，故相當大一部分鳥蛤科貝類種間關系一直存在爭議，分類十分混亂。?

近年來，隨著分子技術不斷發展，利用DNA序列對物種進行分類和系統發育分析已成為一種高效而簡單的方法，特別是鑒定形態不易區分或缺少形態學數據的種。其中線粒體16SrRNA基因因其單親遺傳，無重組，中性進化，突變速率適中等特點成為物種鑒定和研究物種進化關系的理想基因之一。該基因一經引用就迅速傳播開來，在無脊椎動物系統分類、種類鑒別、群體遺傳多樣性和分子進化方面得到廣泛應用。因此，利用16S?rRNA基因對鳥蛤科進行物種鑒定和系統發育分析是一種很有前景的方法。?

然而貝類16S?rRNA序列的變異速率明顯高于動物的其他類群，軟體動物不同物種，即使是近緣種甚至種內不同群體之間的16S?rRNA序列變異都很大，因此其非特異性擴增引物的擴?增效率低下，有些物種根本無法擴出。缺少擴增效率高的引物嚴重阻礙了這種分子標記應用，因此篩選鳥蛤科線粒體16S?rRNA基因特異性擴增引物，對利用分子方法鑒定鳥蛤科物種和進行系統發育分析具有重要的意義，同時也能為利用16S?rRNA基因研究鳥蛤系統地理學、保護鳥蛤科種質資源和選擇合適的養殖品種提供技術條件。?

發明內容

本發明目的是提供一種鳥蛤科貝類線粒體16S?rRNA基因適用性好的擴增引物，它能滿足現有技術的上述需求。?

本發明根據鳥蛤科物種16S?rRNA基因序列變異度較高和非特異性擴增引物擴增效率低的特性，通過重復試驗，篩選出鳥蛤科貝類16S?rRNA基因特異性擴增引物。采用本發明的16S?rRNA基因擴增引物，可以有效的擴增出鳥蛤科不同物種的16S?rRNA序列，更有利于鳥蛤科的物種遺傳多樣性的研究。?

具體實施方式

本發明的鳥蛤科貝類線粒體16S?rRNA基因擴增引物的篩選方法采用三個步驟：a、利用16S?rRNA通用擴增引物擴增出部分鳥蛤科物種的16S?rRNA序列；b、從上述得到的鳥蛤科16SrRNA序列中，通過比對找出保守的序列片段，合成多套擴增引物序列；c、從合成的多套擴增引物序列中篩選出擴增鳥蛤科線粒體16S?rRNA基因效果最好的一對引物。?

下面結合實施例對本發明作進一步說明：?

1.樣品采集：于2000年～2012年，從中國南北沿海共采集鳥蛤科12個屬24個種類的218個個體。?

2.DNA提取：用苯酚-氯仿法對所采集樣品進行DNA提取。?

3.16S?rRNA通用擴增引物擴增：利用Palumbi于1996年設計的16S?rRNA通用擴增引物?

16S?rRNAar(5’-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3’)?

16S?rRNAbr(5’-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3’)?

對上述采集的鳥蛤科218個個體進行PCR擴增。不同物種的PCR熱循環退火溫度不同，退火溫度范圍為42℃～50℃。擴增產物經1.5倍的瓊脂糖電泳檢測后，送往測序公司進行雙向測序。用Lasergene軟件將測得的序列進行人工矯正。最終獲得10個種53個個體的?