[發(fā)明專(zhuān)利]一株高效轉(zhuǎn)化黃姜皂苷為薯蕷皂苷元的菌種及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310040614.8
• 申請(qǐng)日: 2013-02-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103103154A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李會(huì);史勁松;張佳佳;許正宏;馬洋;謝婉玲;張曉梅;李恒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12P33/20;C12R1/01
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas?sp.）ST-03及其高效轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法。

背景技術(shù)

薯蕷皂苷苷元是生產(chǎn)甾體激素類(lèi)藥物的重要基礎(chǔ)原料。甾體激素藥物是僅次于抗生素的第二類(lèi)藥物,?具有很強(qiáng)的抗感染、抗過(guò)敏、抗病毒和抗休克等藥理作用。近年來(lái),甾體藥物在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大,?被廣泛用于治療風(fēng)濕病、心血管、膠原性病癥、淋巴白血病、人體器官移植、抗腫瘤、細(xì)菌性腦炎、皮膚病、內(nèi)分泌失調(diào)、老年性疾病等。目前大概有超過(guò)一千種甾體激素類(lèi)藥物是由薯蕷皂苷元合成或者半合成的。國(guó)內(nèi)外薯蕷皂苷元的提取工藝主要是直接酸水解法和預(yù)發(fā)酵法，以及一些在此兩種方法基礎(chǔ)上的改進(jìn)等方法，這些方法中均有酸水解這一工序，產(chǎn)生大量含酸廢液，對(duì)環(huán)境的污染比較嚴(yán)重。利用微生物進(jìn)行薯蕷皂苷元的轉(zhuǎn)化可以實(shí)現(xiàn)綠色高效的生產(chǎn)，能夠有效的克服化學(xué)合成方法的毒性大、專(zhuān)一性不強(qiáng)和轉(zhuǎn)化效率不高的弊端。

黃姜中的皂苷成分復(fù)雜，而且多數(shù)是脂溶性化合物，水溶性很低，因此轉(zhuǎn)化過(guò)程中底物投料濃度和轉(zhuǎn)化效率都非常低，相對(duì)于研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)木霉屬和曲霉屬的一些微生物，雖然將黃姜中的皂苷轉(zhuǎn)化為薯蕷皂苷元進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的條件溫和，環(huán)境友好，但是這些微生物的轉(zhuǎn)化效率低，副產(chǎn)物多，并不能真正的進(jìn)入工業(yè)生產(chǎn)。因此篩選一株高效轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯蕷皂苷元的微生物具有非常重要的意義，而目前關(guān)于鞘氨醇單胞菌屬用于轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯蕷皂苷元的研究未見(jiàn)報(bào)道，其生產(chǎn)薯蕷皂苷元的高收率更是工業(yè)生產(chǎn)的一大優(yōu)勢(shì)。發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一株高效轉(zhuǎn)化產(chǎn)生薯蕷皂苷元的鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas?sp.）ST-03，以及利用該菌株轉(zhuǎn)化生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法，可達(dá)到高產(chǎn)物得率的要求。

本發(fā)明的發(fā)明人從實(shí)驗(yàn)室保存的真菌中篩選到一株轉(zhuǎn)化產(chǎn)生薯蕷皂苷元的微生物，該菌株為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas?sp.）ST-03，保藏在位于北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路的中國(guó)科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.6836，分類(lèi)命名為Sphingomonas?sp.，保藏日期為2012年11月19日。

應(yīng)用上述微生物轉(zhuǎn)化黃姜中皂苷生產(chǎn)薯蕷皂苷元的方法，其步驟如下：

（1）采用保藏號(hào)為CGMCC?No.6836的鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas?sp.）ST-03為生產(chǎn)菌種，按照常規(guī)方法進(jìn)行活化培養(yǎng)得到種子液，將該種子液涂布到查氏培養(yǎng)基上；

（2）制備ST-03菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物：挑取步驟（1）的查氏固體培養(yǎng)基上的ST-03菌株一環(huán)，接種于已滅菌的裝有30-50?mL種子培養(yǎng)基的250?mL錐形瓶中，培養(yǎng)溫度為30-40℃，置搖床上以170-220?r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24-28?h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，即得到ST-03菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物；

（3）發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（2）中制備好的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以3-7%（w/w）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為500?mL錐形瓶中裝60-90?mL發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為30-40℃，在170-210?r/min的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24-28?h，獲得發(fā)酵液。

（4）生物轉(zhuǎn)化：精確稱(chēng)取適量黃姜皂苷，投入步驟（3）中的菌體發(fā)酵液，使其終濃度為3-5?g/L，在轉(zhuǎn)化溫度37℃，170-210?r/min的轉(zhuǎn)速下轉(zhuǎn)化140-170?h，即得轉(zhuǎn)化液。

（5）產(chǎn)物檢測(cè)：將步驟（4）的轉(zhuǎn)化液在7000-11000?r/min下離心4-9?min，沉淀用與轉(zhuǎn)化液同體積的60?℃-90℃石油醚抽提3次，合并抽提液后于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋至有晶體出現(xiàn)，乙腈復(fù)溶晶體并通過(guò)0.22?μm的有機(jī)膜過(guò)濾除雜，濾液利用高效液相色譜法分析薯蕷皂苷元的含量。