[發(fā)明專利]孔鰩軟骨多肽類血管生成抑制因子及其制備方法和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310040317.3
• 申請日: 2013-02-01
• 公開（公告）號: CN103204907A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王斌;胡發(fā)遠(yuǎn);羅紅宇;徐銀峰
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海洋學(xué)院
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/18;C07K1/16;C12P21/06;A61K38/08;A61P9/00;A61P35/00
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.孔鰩軟骨多肽類血管生成抑制因子，其特征在于該孔鰩軟骨多肽類血管生成抑制因子的氨基酸序列為Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu??SEQ?ID?NO:1，ESI/MS檢測給出分子離子峰m/z?793.11Da（[M+H]⁺）。

2.一種權(quán)利要求1所述的孔鰩軟骨多肽類血管生成抑制因子的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）以孔鰩軟骨為原料，按固液比1?g：5~10?mL加入到濃度為1.0?mol/L的鹽酸胍溶液中（含0.02?mol/L?MES和0.02?mol/L?EDTA，pH?7.6），于4?℃振蕩抽提36~48?h，抽提溶液于4?℃以下，以4?000?r/min離心15~25?min，去除殘?jiān)占锨逡海簧锨逡豪^續(xù)在4℃下12000?r/min離心20~25?min，取上清液；將上清液裝入截留分子量為3?kDa的透析袋中，利用Tris-HCl（0.02?mol/L，pH?7.6）緩沖液于4℃下透析靜置18~30?h，每隔6?h更換Tris-HCl（0.02?mol/L，pH?7.6）緩沖液1次，透析袋內(nèi)溶液即為孔鰩軟骨粗提液；

2）孔鰩軟骨粗提液置于4?℃下預(yù)冷0.5~1?h，緩慢加入4?℃下預(yù)冷的丙酮至其濃度為30%，靜置0.5~1?h后，于4?℃以下9?000?r/min離心15~25?min，取離心上清液加入4?℃下預(yù)冷的丙酮至丙酮濃度達(dá)60%，靜置0.5~1?h后，4?℃以下9?000?r/min離心15~25?min，取沉淀置于截留分子量為3?kDa?的透析袋內(nèi)用Tris-HCl（0.02?mol/L，pH?7.6）緩沖液透析24~36?h，每隔6?h更換Tris-HCl（0.02?mol/L，pH?7.6）緩沖液1次，透析液冷凍干燥，得孔鰩軟骨蛋白；

3）取凍干孔鰩軟骨蛋白，按照料液比1?g：3~5?mL加入Tris-HCl緩沖液（0.02?mol/L，pH為?7.5~8.5），按照軟骨粗蛋白質(zhì)量的2.0~3.0%加入胰蛋白酶，于溫度35~45℃下酶解3~5?h，得孔鰩軟骨蛋白酶解產(chǎn)物；

4）將制備的孔鰩軟骨蛋白酶解產(chǎn)物先經(jīng)滅酶處理得孔鰩軟骨蛋白酶解液，再將酶解液依次經(jīng)超濾、脫鹽和層析，得到孔鰩軟骨多肽類血管生成抑制因子。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3）中的胰蛋白酶的酶活力≥2.5×10^4?U/g。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟4）中的滅酶處理為：將孔鰩軟骨蛋白酶解產(chǎn)物升溫至90~95℃，并于此溫度保持10~15min后，冷卻至室溫，然后離心，得孔鰩軟骨蛋白酶解液。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3）的超濾、脫鹽和層析的具體過程為：

超濾：將孔鰩軟骨蛋白酶解液于0.1~0.15?MPa的工作壓力和20~25?℃的工作溫度下采用1?kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于1?kDa部分，即為超濾酶解液；

脫鹽：將超濾酶解液制成濃度為10~20?mg/mL溶液，加入到大孔樹脂層析柱，然后用質(zhì)量濃度70~80%乙醇進(jìn)行洗脫，得脫鹽酶解液，脫鹽酶解液于50?℃以下低壓旋蒸除去乙醇后，冷凍干燥得脫鹽酶解物干粉；

層析：將上述脫鹽酶解物干粉溶于雙蒸水配成濃度為10~20?mg/mL的溶液，經(jīng)過陰離子交換樹脂分離，用水、0.09~0.11?mol/L、0.45~0.55?mol/L和0.90~1.10?mol/L?NaCl溶液進(jìn)行洗脫，根據(jù)220?nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制作用最高組分為離子交換層析酶解物；將上述離子交換層析酶解物用雙蒸水配成8~12?mg/mL的溶液，經(jīng)過凝膠柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)220?nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，對雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制作用最高組分為凝膠層析酶解物，將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成45~55?μg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，根據(jù)對雞胚絨毛尿囊膜血管生成抑制作用得1個(gè)高血管生成抑制作用多肽Gly-Glu-Glu-Gly-Thr-Met-Gly-Leu???SEQ?ID?NO:1。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述大孔樹脂為D101。