[發明專利]基于DNA文庫濃度遞減的核酸適配體篩選方法及核酸適配體

有效

• 申請號: 201310040069.2
• 申請日: 2013-02-01
• 公開（公告）號: CN103966222B
• 公開（公告）日: 2017-05-17
• 發明（設計）人: 趙永祥;李霞;盧小玲
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10
• 代理公司: 深圳市順天達專利商標代理有限公司44217
• 代理人: 郭偉剛,周嬌嬌

1.一種基于DNA文庫濃度遞減的核酸適配體篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

蛋白磁珠交聯步驟，將對照蛋白和靶蛋白分別與磁珠交聯，得到對照蛋白磁珠復合物和靶蛋白磁珠復合物；所述靶蛋白為內皮糖蛋白，所述對照蛋白為牛血清蛋白；

第一輪篩選步驟，在初始DNA文庫溶液中加入所述靶蛋白磁珠復合物進行正篩選并洗脫后，進行PCR擴增，分離為單鏈，得到第一輪篩選產物；

重復篩選步驟，將前一輪篩選產物稀釋2～10倍作為下一輪篩選的DNA文庫溶液，先加入對照蛋白磁珠復合物進行負篩，再加入靶蛋白磁珠復合物進行正篩，并在洗脫后得到本輪篩選產物和上清；將每輪篩選產物及上清中的DNA進行PCR擴增，并比較每輪篩選產物和上清中的DNA量是否滿足預設要求，是則得到最終篩選產物執行合成DNA步驟，否則利用未進行PCR擴增的本輪篩選產物執行重復篩選步驟進行下一輪篩選；

合成DNA步驟，經3～4輪篩選對所述最終篩選產物進行克隆和測序，合成在數量上占優勢的DNA序列，并經檢測將能與所述靶蛋白特異性結合并具有高親和力的DNA序列作為該蛋白的核酸適配體；所述高親和力為DNA序列與內皮糖蛋白的平衡解離常數在微摩爾至納摩爾之間。

2.根據權利要求1所述的基于DNA文庫濃度遞減的核酸適配體篩選方法，其特征在于，所述第一輪篩選步驟具體包括：

正篩步驟：取初始DNA文庫溶液于95℃加熱并置冰上迅速冷卻，加入靶蛋白磁珠復合物，置于37℃搖床孵育1.5～2.5h，移去上清，用緩沖液洗滌三次；

文庫洗脫步驟：加入無菌水后在95℃加熱15～20分鐘，冰上冷卻，置磁力架3～5分鐘，取上清；

PCR擴增步驟：以該上清為模板DNA文庫溶液，并將該模板DNA文庫溶液擴增16～20個循環后，分離單鏈并脫鹽處理，得到第一輪篩選產物。

3.根據權利要求2所述的基于DNA文庫濃度遞減的核酸適配體篩選方法，其特征在于，所述重復篩選步驟具體包括：

文庫的預處理步驟：將前一輪篩選產物取稀釋2～10倍后做為下一輪篩選的DNA文庫溶液，在95℃加熱并置冰上迅速冷卻；

反篩步驟：取對照蛋白磁珠復合物3～10ug加入預處理得到的DNA文庫溶液中，37℃搖床孵育30分鐘～1.5小時，置磁力架上收集上清；

正篩步驟：將反篩得到的上清稀釋，加入靶蛋白磁珠復合物3～10ug，37℃搖床孵育30分鐘～1.5小時，移除上清，用緩沖液清洗三次，得DNA靶蛋白磁珠復合物；

文庫洗脫步驟：在DNA靶蛋白磁珠復合物中加入無菌水，95攝氏度加熱15～20分鐘，冰上冷卻，置磁力架3～5分鐘，收集上清；重復用無菌水洗滌，收集每次的上清混合得到該輪篩選產物。

4.一種核酸適配體，其特征在于，采用根據權利要求1-3中任意一項所述的基于DNA文庫濃度遞減的核酸適配體篩選方法制備獲得。