[發明專利]苦杏仁蛋白來源的血管緊張素轉換酶抑制肽及其制備方法

有效

• 申請號: 201310039541.0
• 申請日: 2013-01-31
• 公開（公告）號: CN103122022A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發明（設計）人: 朱振寶;易建華;周慧江;劉曠
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;A61P9/12;C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/20;C07K1/16
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 汪人和

1.一種苦杏仁蛋白來源的血管緊張素轉換酶抑制肽，其特征在于：該抑制肽具有如SEQ.ID.NO.1所示的氨基酸序列。

2.一種如權利要求1所述苦杏仁蛋白來源的血管緊張素轉換酶抑制肽的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）將苦杏仁粉碎，然后經石油醚脫脂后過篩得苦杏仁脫脂粉，用堿溶酸沉法提取苦杏仁脫脂粉中的苦杏仁蛋白，將苦杏仁蛋白冷凍干燥得苦杏仁分離蛋白粉；

2）將苦杏仁分離蛋白粉與水混合得蛋白溶液，向蛋白溶液中加入苦杏仁分離蛋白粉質量2%的堿性蛋白酶，然后調節蛋白溶液的pH為7.0、溫度為50℃后恒溫反應4h得酶解液，將酶解液于沸水中滅酶，然后離心；

3）離心后取上清液，將上清液經截留分子量為1KDa的超濾膜過濾得透過液，將透過液真空濃縮、冷凍干燥得凍干粉末；

4）將凍干粉末進行凝膠過濾色譜分離得到兩個組分，分別測定兩個組分的血管緊張素轉換酶抑制活性，將兩個組分中血管緊張素轉換酶抑制活性較高的組分記為組分2；

5）將組分2進行反相高效液相色譜分離，將分離得到的組分分別經血管緊張素轉換酶抑制活性檢測后確定血管緊張素轉換酶抑制活性最高的組分，記為組分e；

6）將組分e經分析型RP-HPLC系統繼續分離純化，將分離純化所得組分進行血管緊張素轉換酶抑制活性檢測確定血管緊張素轉換酶抑制活性最高的組分，即為目標抑制肽。

3.根據權利要求2所述一種苦杏仁蛋白來源的血管緊張素轉換酶抑制肽的制備方法，其特征在于：所述堿性蛋白酶為Alacase2.4L，酶活力是2.4AU/g。

4.根據權利要求2所述一種苦杏仁蛋白來源的血管緊張素轉換酶抑制肽的制備方法，其特征在于：超濾膜過濾后分子量小于1KDa組分的IC₅₀為0.15±0.007mg/mL。

5.根據權利要求2所述一種苦杏仁蛋白來源的血管緊張素轉換酶抑制肽的制備方法，其特征在于：所述凝膠過濾色譜分離的方法為：用Sephadex?G-15對凍干粉末進行分離，上樣前將凍干粉末溶解于超純水中，上樣濃度為200mg/mL，上樣量為2mL，洗脫液為質量分數0.1%的三氟乙酸水溶液，洗脫液流速為0.5mL/min，分別收集洗脫體積為200-275mL和280-500mL的洗脫液。

6.根據權利要求2所述一種苦杏仁蛋白來源的血管緊張素轉換酶抑制肽的制備方法，其特征在于：所述反相高效液相色譜采用PRC-ODS色譜柱，進樣前，將100mg組分2溶解于100mL的超純水中，進樣量為500μL，流動相A為質量分數0.1%的三氟乙酸乙腈溶液，流動相B為質量分數0.1%的三氟乙酸超純水溶液；洗脫條件為：0～30min，90%～75%流動相B；30～40min，75%～90%流動相B，流速為14mL/min，檢測波長為214nm。

7.根據權利要求2所述一種苦杏仁蛋白來源的血管緊張素轉換酶抑制肽的制備方法，其特征在于：所述組分2經反相高效液相色譜分離出a、b、c、d、e五個組分，五個組分的血管緊張素轉換酶抑制率分別為10%、25.6%、25.0%、24.3%以及41.9%。

8.根據權利要求2所述一種苦杏仁蛋白來源的血管緊張素轉換酶抑制肽的制備方法，其特征在于：所述分析型RP-HPLC系統采用C₁₈色譜柱；紫外檢測器檢測波長214nm；流動相A為質量分數0.1%的三氟乙酸超純水溶液，流動相B為質量分數0.07%的三氟乙酸乙腈溶液；流速為1.0mL/min；進樣量為20μL；柱溫為30℃；梯度洗脫條件為0~20min，20~25%流動相B；20~30min，25~15%流動相B；30~40min，15~10%流動相B。