[發明專利]一種異育銀鯽鰓上皮細胞的分離、純化、培養和傳代方法

無效

• 申請號: 201310037191.4
• 申請日: 2013-01-31
• 公開（公告）號: CN103122333A
• 公開（公告）日: 2013-05-29
• 發明（設計）人: 王彥波;傅玲琳
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黎雙華

1.一種異育銀鯽鰓上皮細胞的分離、純化、培養和傳代方法，其特征是包括以下步驟：

(1)?鰓上皮組織的取樣：選取50-100g的健康異育銀鯽禁食24h后經麻醉，放入70％乙醇中消毒l?min；在無菌室中取出鰓，用磷酸鹽緩沖液沖洗數次，去除鰓黏液，將鰓剪碎得體積為0.9-1.1?mm³的組織塊，備用；

(2)?制備培養液：在每毫升DMEM培養基中添加0.1μg上皮細胞生長因子、0.1IU胰島素、100IU青霉素、100μg鏈霉素和0.1ml胎牛血清；

(3)?組織塊培養：在步驟(1)得到的異育銀鯽鰓組織塊中加入0.25%胰蛋白酶，28℃水浴中振蕩消化20min，吸管反復吹打直到光鏡下出現大量細胞及細胞團，并加入含5％胎牛血清的DMEM終止消化，1000?r/min離心5?min，棄上清液，加入步驟(2)的培養液制得細胞懸液，再將其接種至24孔板培養，置25-30℃，5％CO₂培養箱培養；培養90?min后，把培養液連同未貼壁的細胞轉入新的培養板繼續培養，培養至細胞覆蓋80%板底表面積時，得到原代培養的鰓上皮細胞；

(4)?鰓上皮細胞的純化：采用反復貼壁法，將步驟(3)得到的鰓上皮細胞經過濾、計數調整細胞密度至5×10⁴?/ml，種植在細胞培養瓶中，置25-30℃，5％CO₂培養箱培養；待細胞鋪展到板底80%時，再依次重復1-2次，得到預純化鰓上皮細胞；去除培養基，并用Hanks液沖洗，隨后加入質量濃度為0.15%的胰酶和0.02%乙二胺四乙酸混合消化液，至倒置顯微鏡下觀察80-90%細胞回縮時終止，得到純化后的鰓上皮細胞；

(5)鰓上皮細胞的傳代培養：將步驟(4)純化后的鰓上皮細胞離心，并用培養液清洗細胞2-3遍，去掉上清，用培養液重新懸浮細胞，以5×10⁴?/ml的密度植入培養瓶中于25-30℃，5％CO₂培養箱培養，隔日更換培養液。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征是步驟（3）中，培養板中鰓組織塊之間的距離為0.2-0.3cm。