[發明專利]焦磷酸測序技術檢測隱孢子蟲的方法

有效

• 申請號: 201310036854.0
• 申請日: 2013-01-31
• 公開（公告）號: CN103103277A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 孫濤;鄧明俊;肖西志;王群;鄭小龍;凌宗帥
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/90
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種焦磷酸測序技術檢測隱孢子蟲的方法，其特征在于，首先依據隱孢子蟲18S?rRNA設計特異性引物及焦磷酸測序引物；再提取待測樣品的脫氧核糖核酸(DNA)，然后分別以18S?rRNA基因的特異性引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增；用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，若引物擴增片段長度為201bp，則制備焦磷酸測序單鏈模板，再進行焦磷酸測序反應，最后根據PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有賈第鞭毛蟲；所述的設計隱孢子蟲的特異性引物及焦磷酸測序引物是根據該蟲的18S?rRNA基因序列，選取保守序列，通過Assay?Design?SW軟件設計特異性引物序列，以擴增出特異性單一條帶，再根據擴增區域中包含的特異核苷酸序列(目標序列)設計焦磷酸測序引物以確證是否為隱孢子蟲；隱孢子蟲PCR及測序引物為：

18S?rRNA基因上游引物5’-CTTGAATACTCCAGCATGGAATAA-3’，5’進行生物素標記

18S?rRNA基因下游引物5’-TCCCCTAACTTTCGTTCTTGATT-3’，

18S?rRNA基因測序引物5’-ATACAAATGCCCCCA-3’；

隱孢子蟲18S?rRNA基因的目標序列：ACTGTCCCTA?TTAATCATTA?TTCTT；擴增片段長度為201bp。

2.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測隱孢子蟲的方法，其特征在于，所述的提取待測樣品的DNA是利用隱孢子蟲包囊的糞便經100目系統網過濾，濾液用酚-氯仿法抽提而得；亦可用商業化的DNA提取試劑盒提取。

3.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測隱孢子蟲的方法，其特征在于，所述的以該蟲18S?rRNA引物進行PCR擴增：其中，上下游引物擴增是將提取的待測樣品DNA進行PCR擴增，擴增溶液中加入2×PCR?buffer(10倍聚合酶鏈式Mix反應液)12.5μL，10pmol/μL上游引物和下游引物各0.5μL，DEPC水補足體積至25μL，PCR循環條件為：94℃預變性5min后，進入94℃變性30s，46℃退火30s，72℃延伸30s，共循環50次；然后72℃再延伸10min。

4.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測隱孢子蟲的方法，其特征在于，所述的PCR擴增產物電泳檢測：取2g瓊脂糖，于100mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5μg/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠；將3μL～6μL?PCR擴增產物分別和適量加樣緩沖液混合，點樣；9V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠中部；紫外檢測儀下觀察電泳結果并記錄。

5.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測隱孢子蟲的方法，其特征在于，所述的制備焦磷酸測序單鏈模板：使用50μl標記有生物素的PCR產物與200μg鏈霉親和素包被的磁珠，在室溫25℃下孵育20分鐘，用vacuum?prep?tool將與磁珠結合后的PCR產物吸起，然后在70％乙醇中清洗5s；denatureation?buffer(變性緩沖液)洗5s；最后移到washing?buffer(沖洗緩沖液)中清洗10s：然后將vaccum?prep?tool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放磁珠。將樣品放入80℃烘箱2分鐘，再冷卻到室溫。

6.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測隱孢子蟲的方法，其特征在于，所述的焦磷酸測序反應：測序反應在室溫下于焦磷酸測序儀上檢測，加樣使用600毫巴/8毫秒的加樣壓力和時間，每輪反應時間65秒，引物鏈隨著不同dNTP的加入而延伸，隨著核酸的結合，CCD攝像機檢測到發出的光信號，讀出DNA序列。

7.根據權利要求1所述的焦磷酸測序技術檢測隱孢子蟲的方法，其特征在于，所述的關于根據PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有隱孢子蟲：PCR反應為陽性的，進行焦磷酸測序分析，測序片段與18S?rRNA基因目標片段完全相同的，確定為隱孢子蟲；PCR反應為陽性的，測序片段與目標片段有一個以上堿基不同判定為非隱孢子蟲；PCR反應為陰性的判定為非隱孢子蟲。