[發(fā)明專利]一種可再生的生物素結(jié)合蛋白芯片及其制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310036171.5
• 申請(qǐng)日: 2013-01-30
• 公開（公告）號(hào): CN103088435A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 歐惠超;羅昭鋒;周宏敏;羅炎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
• 主分類號(hào): C40B50/06
• 分類號(hào): C40B50/06;C40B40/10
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責(zé)任公司 34101
• 代理人: 汪祥虬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白芯片及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及可再生的生物素結(jié)合蛋白芯片及其制備方法。

背景技術(shù)

據(jù)《現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)》(2001，28.4:485-486)介紹，具有親和分子層表面的載體介質(zhì)，如親和樹脂、生物膜和生物芯片等，因其可以特異結(jié)合帶特定結(jié)構(gòu)的蛋白、多肽、DNA序列等，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)等領(lǐng)域，成為生物學(xué)的重要分析方法和手段之一。在眾多的親和分子層中，具有生物素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)的親和芯片是較為常用的一種，它能特異性地結(jié)合帶有生物素標(biāo)簽的蛋白、多肽、DNA、RNA等。但現(xiàn)有商品化的生物素結(jié)合蛋白芯片產(chǎn)品都是一次性使用的，因?yàn)槠渖锼亟Y(jié)合蛋白分子層是通過共價(jià)鍵結(jié)合的方式固定到載體介質(zhì)上的，如要進(jìn)行再生處理，必須采用強(qiáng)氧化劑（如濃硫酸、硝酸、高氯酸、雙氧水等）將載體介質(zhì)表面的所有基質(zhì)和生物素結(jié)合蛋白分子層進(jìn)行徹底的消解，然后再重新構(gòu)建表面基質(zhì)和生物素結(jié)合蛋白分子層，這樣的再生方法操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本也高，且需用到強(qiáng)氧化劑和有機(jī)溶劑會(huì)造成環(huán)境污染，因此現(xiàn)有商品化的生物素結(jié)合蛋白芯片產(chǎn)品一般都是不做再生處理的。

中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?00910144805.2公開的《一種可再生的生物素結(jié)合蛋白分子層及其制備方法》，利用氮川三乙酸分子可通過金屬離子捕獲帶組氨酸標(biāo)簽分子的特點(diǎn)，通過將具有氮川三乙酸結(jié)構(gòu)的分子層先后在金屬離子和帶組氨酸標(biāo)簽的生物素結(jié)合蛋白溶液中進(jìn)行浸泡，制備出了具有生物素結(jié)合蛋白表面的分子層。由于此生物素結(jié)合蛋白分子層可以通過金屬離子螯合劑洗脫下來，因此具有可再生、可重復(fù)利用的性質(zhì)。但該方法是通過螯合離子后再配對(duì)帶組氨酸標(biāo)簽的生物素結(jié)合蛋白，螯合的離子本身就不是非常穩(wěn)定，加上離子配對(duì)帶組氨酸標(biāo)簽的生物素結(jié)合蛋白一般只有2-6個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因此其整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性還不是很好，而且再生制備過程需要重復(fù)兩個(gè)步驟，即須先后在金屬離子和帶組氨酸標(biāo)簽的生物素結(jié)合蛋白溶液中浸泡，再生效率尚不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提出一種可再生的生物素結(jié)合蛋白芯片及其制備方法，以克服現(xiàn)有生物素結(jié)合蛋白芯片不可重復(fù)使用的缺點(diǎn)。

本發(fā)明的可再生生物素結(jié)合蛋白芯片的制備方法，通過可再生的DNA配對(duì)方式固定事先經(jīng)過修飾的生物素結(jié)合蛋白分子；其特征在于：

取一種雙鏈DNA，其中的一條單鏈DNA的末端帶有活性基團(tuán)，另一條單鏈DNA為與生物素結(jié)合蛋白相連的互補(bǔ)鏈；

首先將末端帶有活性基團(tuán)的單鏈DNA，與具有純金膜表面的固相載體，或與表面帶有活性基團(tuán)的固相載體進(jìn)行反應(yīng)，形成物理吸附或共價(jià)連接，從而將該單鏈DNA固定于固相載體表面；

再通過該單鏈DNA與互補(bǔ)鏈的堿基配對(duì)，將與互補(bǔ)鏈相連的生物素結(jié)合蛋白固定到固相載體表面，從而得到可再生的生物素結(jié)合蛋白芯片。

所述生物素結(jié)合蛋白選自卵白素（Avidin）、鏈霉親和素（Streptavidin）或中性親和素（Neutravidin）。

所述活性基團(tuán)選自巰基（-SH）、氨基（-NH₂）、羧基（-COOH）或醛基（-CHO）。

所述固相載體選自玻璃片、硅片、塑料片、親和樹脂、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚丙乙烯，或它們的微粒。

采用本發(fā)明的上述方法制備得到的本發(fā)明的可再生的生物素結(jié)合蛋白芯片，其特征在于：該芯片的固相載體表面具有雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，其中一條單鏈DNA通過物理吸附或共價(jià)連接的方式固定在固相載體表面，另一條單鏈DNA為與生物素結(jié)合蛋白相連的互補(bǔ)鏈，通過單鏈DNA與互補(bǔ)鏈的堿基配對(duì)使得與互補(bǔ)鏈相連的生物素結(jié)合蛋白固定在固相載體表面；

所述生物素結(jié)合蛋白選自卵白素（Avidin）、鏈霉親和素（Streptavidin）或中性親和素（Neutravidin）。

所述固相載體選自玻璃片、硅片、塑料片、親和樹脂、硝酸纖維素膜、尼龍膜或聚丙乙烯，或它們的微粒。

本發(fā)明的制備方法由于采取先將單鏈DNA固定在固相載體表面，再利用DNA堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理，把與生物素結(jié)合蛋白相連的互補(bǔ)鏈固定到固相載體上，制備出了具有生物素結(jié)合蛋白表面的蛋白芯片。該生物素結(jié)合蛋白芯片通過采用0.001-10M堿溶液進(jìn)行沖洗，便能破壞固相載體表面的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，使得與生物素結(jié)合蛋白相連的互補(bǔ)鏈被洗脫下來，再次進(jìn)樣與生物素結(jié)合蛋白相連的互補(bǔ)鏈，便可重新制備出生物素結(jié)合蛋白芯片。因此這種生物素結(jié)合蛋白芯片具有可再生、可重復(fù)利用的性質(zhì)。