[發明專利]桑黃菌中環二肽C2的分離技術

有效

• 申請號: 201310035976.8
• 申請日: 2013-01-30
• 公開（公告）號: CN103073551A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 宋愛榮;趙晨;孫效樂;田雪梅;孔超
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C07D487/04
• 分類號: C07D487/04;A01G1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物工程制藥領域。

背景技術

桑黃（Phellinus），子實體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木質，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時常龜裂，無皮殼，初期有細微絨毛，后變無毛，有同心環棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側無子實層.菌肉深咖啡色，硬，木質.菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲.管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個.孢子近球形，光滑，無色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無橫隔，直徑3-5微米。

目前，真菌產物的純化方法較多，主要有分級沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等幾種方法。而其中應用最多的當屬柱層析法，分為兩類：一是只有分子篩作用的凝膠柱層析，?常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。二是離子交換層析。但，主要用于分離多糖，透明質酸等，多數分離后得到的產物為混合物。本發明使用多種層析技術相結合，分離度高，應用此發明可以精致到純品。

發明內容

本發明公開了一種桑黃菌（火木層孔菌Phellinus?igniarius(L?ex?Fr)?Quel、裂蹄木層孔菌?phellinus?linteus?(Berk?et?Curt)?Teng?、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌?Phellinus?hartigii?(Allesch?et?Schnabl)?Imaz）中環二肽C2的分離方法。首先制備桑黃菌粗提物，然后進行正相硅膠層析，采用氯仿甲醇梯度洗脫，進行TLC檢測，再次使用正相硅膠層析，然后是甲醇凝膠層析，經PLC檢測后，進行反相硅膠層析，適當合并洗脫液，減壓干燥，再次進行甲醇凝膠層析，經HPLC檢測，即得環二肽C2，即六氫-7??-?羥基-3?-?（苯基甲基）吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4?-?二酮。此化合物具有抑制鰻弧菌繁殖作用。

本發明的技術方案如下：

桑黃粗提物，由下述方法制得：

(1)發酵培養基配方以克/100毫升計是：

玉米淀粉????1-5%?????????????葡萄糖??????1-5%

蛋白胨?????0.1-0.5%??????????酵母膏?????0.1-0.5%

硫酸鎂?????0.1-0.5%??????????磷酸二氫鉀?0.01-0.05%

(2)將桑黃菌種以常規方法接種到裝有液體培養基的三角燒瓶內，以20～35℃溫度，搖瓶轉速為80～280r/min，pH?3～8條件下，震動培養7～15天；培養中當pH值降到2.5～4時，將搖瓶中的種子接種到50L發酵罐的培養液中，以溫度20～35℃，發酵罐壓力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH?3～8，通氣量0.5～1.1vvm，攪拌速度100～280轉/分的條件，培養7～15天，即可利用桑黃菌絲體發酵全液制備桑黃粗提物；

(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發酵全液，將其以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2～1/5；

(4)用體積百分比為60～95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發酵液進行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2～5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達到60～90%；

(5)對步驟(4)所得提取液在50～70℃條件下，加熱1～2小時；以常規方法進行分離，并通過二級過濾除去雜質，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5～1/10；

(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進行干燥，得桑黃粗提物。

分離環二肽C2的方法：

桑黃菌粗提物→正相硅膠層析→氯仿與甲醇梯度洗脫→TLC檢測→正相硅膠層析→甲醇凝膠層析→TLC檢測→反相硅膠層析→甲醇凝膠層析HPLC檢測→減壓蒸干→環二肽C2。

具體方法為：

(1)制備桑黃菌粗提物；

(2)將上述步驟（1）所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫3-5次；

(3)收集步驟（2）中的最后一次洗脫液，減壓干燥，與等體積硅膠拌樣，再次進行正相硅膠層析，使用洗脫劑洗脫；

(4)收集上述步驟（3）中得到的洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當合并洗脫液，減壓干燥；