[發(fā)明專利]一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310035563.X
• 申請日: 2013-01-30
• 公開（公告）號: CN103116030A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔泰興;唐東起;李世武;吳琦;蘇紅霞;葛瑞蕾
• 申請（專利權(quán)）人: 山東東興生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
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• 代理人: 暫無信息

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生化醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒及其檢測方法，可用于Ⅰ型糖尿病的預(yù)測和診斷。

背景技術(shù)

一般的，I型糖尿病是一種自體免疫疾病，機(jī)體受到感染(尤其是病毒感染)、毒物等因素誘發(fā)而產(chǎn)生異常自身體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞損傷，胰島素分泌減少，一旦發(fā)病需要依賴外源性胰島素補(bǔ)充以維持生命，所以Ⅰ型糖尿病又稱胰島素依賴性糖尿病。

此類糖尿病常見于兒童和青年患者，但是它可以在任何年齡段的人群中發(fā)生，并且此類糖尿病的患病率約占總糖尿病病例的10%。可見及早地對Ⅰ型糖尿病進(jìn)行診斷以及高危人群中進(jìn)行預(yù)報具有重要的意義。

對I型糖尿病的診斷主要通過檢測其自身免疫性抗體，抗體主要包括以下幾種：谷氨酸脫羧酶抗體（GAD）、胰島細(xì)胞抗體（ICA）酪氨酸磷酸酶抗體（IA-2A）及胰島素自身免疫性抗體(IAA)。目前測定GAD、IA-2、IAA常用的方法有放射免疫法、酶聯(lián)免疫法；用于ICA測定的主要用間接免疫熒光法，另外也有用酶聯(lián)免疫法及免疫組化法。

放射免疫分析具有許多其它分析方法無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。它既具有免疫反應(yīng)的高特異性，又具有放射性測量的高靈敏度，并且樣品用量少，常可測至皮摩爾量。本方法有時會出現(xiàn)交叉反應(yīng)、假陽性反應(yīng)、組織樣品處理不夠迅速，不能滅活降解酶和鹽，有時會影響結(jié)果等，還存在使用放射性標(biāo)記物所引起的放射線輻射和污染等問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒及其檢測方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是按以下方式實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明利用293細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的一種熒光酶－抗原融合蛋白，可以與病人血清中的糖尿病自身抗體發(fā)生特異性結(jié)合。然后加入蛋白A瓊脂糖，沉淀融合蛋白-抗體復(fù)合物，離心后將未結(jié)合的融合蛋白從上清液中吸走。之后加入熒光素酶底物，利用熒光檢測儀檢測熒光強(qiáng)度，從而測定待測樣品中糖尿病自身抗體的含量。

一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒，該試劑盒包含有：熒光素酶和糖尿病抗原的融合蛋白。

一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒包含有：熒光素酶-GAD65融合蛋白、熒光素酶-IA-2融合蛋白、熒光素酶-IA-2β融合蛋白。

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一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒包含有：

試劑1：

1A：熒光素酶-GAD65融合蛋白，

1B：熒光素酶-IA-2融合蛋白，

1C：熒光素酶-IA-2β融合蛋白；

試劑2：標(biāo)準(zhǔn)液；

試劑3：

3A：空白對照液，

3B：健康人血清對照液；

試劑4：蛋白A瓊脂糖；

試劑5：Ranilla熒光底物。

所述的試劑1的制備方法是：將Ranilla熒光基因與目的基因融合后轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，然后在含有10%?血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)36～60h，將收獲的細(xì)胞在冰浴中超聲處理15～30?min，然后將細(xì)胞裂解液于4℃，以6000～8000rpm轉(zhuǎn)速離心15～45?min后取上清，得到融合蛋白，后分裝凍干成該試劑盒中的試劑1。

標(biāo)準(zhǔn)液是標(biāo)準(zhǔn)抗體NIBSC97/550。

緩沖液是指0.01mol/L，pH7.4磷酸鹽緩沖液。

Ranilla熒光素酶是指：海腎熒光素酶，指熒光素酶的報告基因來自于海腎。就像螢火蟲熒光素酶一樣。

Ranilla熒光基因來自于海腎。

目的基因是指糖尿病抗原基因。將這兩種基因融合后進(jìn)行表達(dá)，會產(chǎn)生融合蛋白，在本專利中分別為熒光素酶-GAD-65融合蛋白、熒光素酶-?IA-2融合蛋白、熒光素酶-IA-2β融合蛋白。

一種檢測I型糖尿病自身免疫抗體試劑盒的檢測方法的步驟是：

試劑盒：

試劑1：

1A：熒光素酶-GAD65融合蛋白，

1B：熒光素酶-IA-2融合蛋白，

1C：熒光素酶-IA-2β融合蛋白；

試劑2：標(biāo)準(zhǔn)液；

試劑3：

3A：空白對照液，

3B：健康人血清對照液；

試劑4：蛋白A瓊脂糖；

試劑5：Ranilla熒光底物；

實(shí)驗(yàn)之前，將試劑盒和緩沖液在室溫下放置至少30min；

（1）對試劑1用緩沖液進(jìn)行一定倍數(shù)的梯度稀釋，要保證抗原有一定的濃度，要求達(dá)到每微升中有10⁷個熒光單位；