[發明專利]一種誘導纖維堆囊菌表達制備埃博霉素的方法

有效

• 申請號: 201310035548.5
• 申請日: 2013-01-30
• 公開（公告）號: CN103088084A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 杜少平;夏楓耿;石笛;戴南藝;黃魁英;趙培靜;秦鵬;藍碧鋒;張競立;陳勉華
• 申請（專利權）人: 廣州市微生物研究所
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 鄭永泉;倪小敏

技術領域

本發明涉及抗腫瘤藥物微生物發酵領域，更具體地，涉及一種誘導纖維堆囊菌表達制備埃博霉素的方法。

背景技術

埃博霉素(epothilone)是一類大環內酯類化合物，從粘細菌亞目的纖維堆囊菌菌株發酵液中可以分離埃博霉素，其主要組分為Epothilone?A和B。它與紫杉醇具有相同的抑制腫瘤細胞生長的作用機制，并且對多重耐藥腫瘤細胞和耐紫杉醇的腫瘤細胞均表現強大的抗癌活性。除具有活性方面的優勢之外，埃博霉素具有較紫杉醇簡單的化學結構和良好的水溶性，而且可以發酵法生產。埃博霉素分子結構如下：?

Epothilones?A?(R?=?H)?and?B?(R?=?CH₃)

????由德國國家生物技術中心(GBF)的G.?Höfle等人于1993年首次報道。至今國外已有六種埃博霉素類化合物進入了臨床試驗，大量的臨床研究結果顯示出該類化合物有極大的藥用價值。目前，國內埃博霉素的研發還處于實驗室水平，還存在生產菌株纖維堆囊菌發酵培養菌體容易聚集成球狀，發酵周期長，埃博霉素表達效率低，產物分離純化效率低等因素影響埃博霉素的工業化生產。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，克服現有技術中埃博霉素表達效率低的不足，提供一種誘導纖維堆囊菌表達制備埃博霉素的方法。

本發明所要解決的技術問題通過以下技術方案予以實現：

一種誘導纖維堆囊菌表達制備埃博霉素的方法，包括如下步驟：

S1.?發酵菌種的制備：將纖維堆囊菌菌種培養至纖維堆囊菌生物量為0.8~1.2×10⁹cfu/mL時，作為發酵菌種備用；

S2.?發酵培養：將S1中的發酵菌種加入發酵培養基中進行培養，當發酵液中纖維堆囊菌生物量大于等于10¹⁰cfu/mL時進行停止發酵培養，得發酵培養物；

S3.?誘導發酵培養：在S2中的發酵培養物中加入誘導組合物進行誘導發酵培養，得誘導發酵培養物；

S4.?分離誘導發酵培養物中的埃博霉素；

其中，S3中所述的誘導組合物包含如下重量百分比的組分：

5~15%甘油、1~10%色氨酸、1~10%半胱氨酸、1~5%酪氨酸、1~10%2,3~二氫吡喃和1~10%酵母提取物；

S3中所述的誘導組合物的添加量為發酵液的1~10（體積）%；

S3中所述的誘導發酵培養條件為：控制溫度32~35℃，PH7.2~7.5，在攪拌、通氣、光照條件下培養12~36h。

本發明通過在S3中添加上述配比的誘導組合物和在S3中所述的發酵培養條件結合，從多方面誘導調控纖維堆囊菌表達，使得纖維堆囊菌能夠高效表達埃博霉素。

作為一種優選方案，S3中所述的誘導組合物包含如下重量百分比的組分：

8~12%甘油、4~8%色氨酸、3~7%半胱氨酸、1~3%酪氨酸、3~7%2,3~二氫吡喃和4%酵母提取物；

所述的誘導組合物的添加量為發酵培養物的3~7（體積）%。

作為一種進一步優選方案，所述的誘導組合物包含如下重量百分比的組分：

10%甘油、5%色氨酸、5%半胱氨酸、2%酪氨酸、?5%2,3~二氫吡喃、4%酵母提取物；

所述的誘導組合物的添加量為發酵培養物的5（體積）%。

作為一種優選方案，S3中所述的誘導發酵培養條件為：控制溫度32~35℃，PH7.2~7.5，在攪拌速度為150~180rpm，通氣量為0.5~0.8?V/?V·min，800~1000Lux光照條件下培養12~36h。

作為一種最優選方案，S3中所述的誘導發酵培養條件為：控制溫度32℃，PH7.5，在攪拌速度為150rpm，通氣量為0.8?V/?V·min，1000Lux光照條件下培養24h。

作為一種優選方案，S2中的發酵培養方法為：將S1中制備得到的發酵菌種按5~10（體積）%的接種量加入發酵培養基中，控制溫度在25~30℃、PH6.8~7.0，攪拌，通氣，培養至發酵液中纖維堆囊菌生物量大于等于10¹⁰cfu/mL。