[發明專利]一種花生中逆境脅迫AhMYBL6基因的克隆及功能表達方法

有效

• 申請號: 201310035449.7
• 申請日: 2013-01-30
• 公開（公告）號: CN103060340A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 陳娜;陳明娜;遲曉元;王通;王冕;潘麗娟;禹山林;楊珍
• 申請（專利權）人: 山東省花生研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.?一種花生逆境脅迫AhMYBL6基因的克隆方法，主要包括以下步驟：

（1）材料的準備與處理：材料選擇花生花育19，花生種子在營養土和蛭石以2：1混合的土中萌發，萌發后幼苗生長條件為16h光照/8h黑暗，溫度為22℃-28℃，生長約2周處于三葉期的花生幼苗用于后續的非生物脅迫處理；

材料的低溫處理，將三葉期花生幼苗放入4℃光照培養箱中進行處理，取處理時間分別為0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生葉片和根作為材料；對于耐鹽用NaCl處理；對于抗旱，用PEG6000處理；將花生從土中取出并小心將根上的土用水沖洗干凈，然后將花生根分別浸泡在200mM?NaCl或重量濃度為20%PEG6000溶液中，在處理0h，1h，3h，h，12h，24h，48h和72h分別取花生的根作為材料，所有材料均保存于-80℃超低溫冰箱中備用；

（2）?RNA的提取和cDNA的合成

按照試劑盒操作手冊的方法用天根的RNeasy?Mini?Kit分離提取花生幼苗cDNA，用RQ1?RNase-free?DNaseI將得到的RNA去除DNA污染后再進行cDNA的合成；用M-MLV?Reverse?Transcriptase進行cDNA的合成，25-μL反應體系中包含2?μg?RNA，在42°C條件下經過60?min的反轉錄反應后將反轉錄產物置于冰上放置5?min，之后將反轉錄產物于-20℃低溫冰箱中保存備用；

（3）AhMYBL6基因克隆

通過RT-PCR進行克隆，PCR擴增所用的聚合酶為LA?Taq^TM?DNA?polymerase，在25-μL體系中加入以下成分：含MgCl₂的2.5?μL?10×?PCR?buffer?；2.5?μL?10?mM?dNTPs；1?μL?cDNA?模板；0.5?μL?LA?polymerase和17.5?μL?ddH₂O；PCR反應條件為：(a)?94℃，5?min；(b)?94℃，45?s；55℃，45?s；72℃，90?s；共35?cycles；?(c)?72℃，?10?min；

擴增基因全長所用引物為AhMYB6-S:?5’-GAAGCAAAGATGGTGA?GA-3’和AhMYB6-A:?5’-AGCCCTAATCAAAGACGA-3’；

PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后用Axygen膠回收試劑盒進行純化，純化產物連接pMD18-T?Easy?vector?并測序。

2.根據權利要求1所述的花生逆境脅迫AhMYBL6基因的克隆方法，其特征在于：所述的AhMYBL6基因開放閱讀框為858bp，共編碼286個氨基酸。

3.根據權利要求1所述的花生逆境脅迫AhMYBL6基因的克隆方法，其特征在于：所述的AhMYBL6基因的氨基酸序列在NCBI網站上通過Blast分析后發現該基因氨基酸序列與大豆的MYB家族蛋白GmMYB4,?GmMYB29,?GmMYB29A2同源性均達到了60%以上。

4.根據權利要求1所述的花生逆境脅迫AhMYBL6基因的克隆方法，其特征在于：所述的AhMYBL6基因的核苷酸序列是序列表中SEQUENCE?1。

5.根據權利要求1所述的花生逆境脅迫AhMYBL6基因的克隆方法，其特征在于：所述的AhMYBL6基因的氨基酸序列是序列表中SEQUENCE?2。