[發明專利]一種剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的熒光定量PCR引物、探針及試劑盒

有效

• 申請號: 201310035350.7
• 申請日: 2013-01-30
• 公開（公告）號: CN103060469A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 王成明;許傳靈;張繼壘;危藍菁
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/01
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及嗜皮菌分子診斷的熒光定量PCR檢測引物、探針及試劑盒。

背景技術

嗜皮菌病是一種以滲出性和增生性皮炎、淺表上有皮壞死并有痂塊形成為特征的皮膚病。此病主要感染牛、綿羊、馬；也可以影響山羊、貓、狗、許多野生動物以及爬行動物。最近，世界各地有很多人感染此病的報道。

嗜皮菌病的實驗室診斷主要依賴于觀察嗜皮菌培養后的特征性菌落和顯微鏡下出現的革蘭氏陽性的分枝菌絲或火車道型成行排列的孢子。然而，培養和其它傳統的實驗室診斷方法的特異性和靈敏度不夠，且耗時長。因此，建立嗜皮菌病診斷的新技術，尤其是早期、快速、高特異性和高靈敏度的檢測技術就顯得尤為重要和迫切。此外，傳統的觀點認為,龜型嗜皮菌僅存在于爬行動物,而剛果嗜皮菌存在于人和其他哺乳動物。我們成功地從患嗜皮菌病牛的皮膚分離出龜型嗜皮菌，本發明可以同時擴增而且分辨剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌。

發明內容

發明的目的在于提供一種快速、特異性強、靈敏度高、適合臨床使用的定量PCR檢測嗜皮菌的引物、探針及試劑盒，同時方便的區分剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌。

本發明的原理和核心是科學地設計擴增和檢測嗜皮菌的特異、高效的引物和探針。在保證設計的引物高效擴增嗜皮菌、設計的探針特異檢測嗜皮菌的同時，確保此引物和探針不擴增和檢測其它類似的微生物。此外，設計的探針和剛果嗜皮菌的基因序列完全吻合，而和龜型嗜皮菌有3個堿基的差異；因此，高分辨率熔點曲線技術會顯示剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的不同熔解溫度，這可以方便的用于基因分型。從GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）獲取如下嗜皮菌和相關細菌的16SrDNA的序列后，用Clustal?Multiple?Alignment?Algorithm的方法對所有序列進行對齊：剛果嗜皮菌（基因序列號：AB550800，AJ243918，FJ708634，HM590697），龜型嗜皮菌（AB550801），放線菌（HQ891175，JF499686，JF820789），棒狀桿菌（FR874223），Kytococcus?sedentarius(EU443746)和Tosilophilus?p.(AB096085)。引物和探針的選擇基于對齊序列的保守區和變異區。附圖1顯示設計的引物和探針：

上游引物擴增嗜皮菌：5’-TTAACACATGCAAGTCGAACGATGAA-3’（SEQ?ID?NO.1）；

下游引物-1擴增剛果嗜皮菌：5’-ATGCGAGGAAAGGTCATATT-3’（SEQ?ID?NO.2）；

下游引物-2擴增龜型嗜皮菌5’-ATGCGGAGAAAGGTCATAGG-3’（SEQ?I?D?NO.3）；

探針-1：5’-TCCCAAAGTGARGGGYAGATTACTCAC-6FAM-3’（SEQ?ID?NO.4）；

探針-2：5‘-LCRed-640-TGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATC-pho?s（磷酸）-3’（SEQID?NO.5）。

本發明還公開了剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括5倍定量PCR反應液22μl,以及22μl的5倍的引物探針混合液含濃度為5μM的上游引物、5μM下游引物-1、5μM下游引物-2、1μM的探針-1、1μM的探針-2）

本發明進一步公開了剛果嗜皮菌和龜型嗜皮菌分型鑒別方法，包括以下步驟：

（1）用上述引物和探針PCR擴增待測菌，擴增出145bp條帶，且熒光檢測在640nm波長增強的為陽性樣本；

（2）PCR完成后，對步驟（1）陽性樣本擴增產物進行高分辨率熔解曲線分析，根據熔解溫度對埃里希氏菌進行分型，剛果嗜皮菌的熔解溫度是－63℃，比龜型嗜皮菌的熔解溫度－55℃。