[發明專利]一種抑制間充質干細胞分化為脂肪細胞的方法

有效

• 申請號: 201310034514.4
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103103213A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 張毅;朱恒;徐芬芬;陳繼德;劉元林
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種抑制間充質干細胞分化為脂肪細胞的方法。

背景技術

間充質干細胞（mesenchymal?stem?cells,?MSCs）是一種具有多向分化潛能的成體干細胞，在適宜的條件下可以分化成為成骨細胞，軟骨細胞和脂肪細胞等多種組織類型的細胞。在生理條件下，間充質干細胞通過分化為多種子代細胞參與機體生長發育和新陳代謝，在病理條件下，參與組織修復。但是值得關注的是，當強烈的損傷因素持續存在，超過了機體的調節范圍之后，間充質干細胞也會參與疾病的病理過程，加重組織損傷。如肝臟疾病時，間充質干細胞分化為成纖維細胞，參與肝臟的纖維化，加重了肝硬化。當機體糖脂肪代謝紊亂時，間充質干細胞持續分化為脂肪細胞，引發肥胖和相關并發癥。因此，如何調節間充質干細胞的分化方向，使之符合機體生理需要，避免加重疾病，是相關領域的重要科學問題和技術難題。

間充質干細胞表面表達多種細胞間粘附分子，以往的研究多關注于其參與細胞間的信號傳遞和間充質干細胞的免疫調節作用。然而，我們最新的研究發現其中一種細胞間粘附分子即細胞間粘附分子1(intercellular?cell?adhesion?molecule,?ICAM-1)能夠調節間充質干細胞的分化方向。ICAM-1屬粘附分子免疫球蛋白超家族(IgSF)，通過與淋巴細胞功能相關抗原-1(lymphocyte?function?associated?antigen-1,?LFA-1)、巨噬細胞分化抗原-1(macrophage?1?antigen,?Mac-1)等受體結合，介導淋巴細胞粘附與遷移，在機體免疫過程和炎性反應中起重要作用。近來有研究表明ICAM-1是MSCs發揮免疫抑制作用的關鍵分子。然而，關于ICAM-1對于MSCs的分化能力是否具有調節作用及其作用機制卻未見報道。本發明通過構建ICAM-1逆轉錄病毒表達載體，轉染MSCs獲得穩定過表達ICAM-1的MSCs，結果表明表達ICAM-1基因可顯著抑制間充質干細胞分化為脂肪細胞，該發現為開展間質干細胞相關基因治療及開發相關的藥品奠定了基礎。

發明內容

本發明的目的在于提供一種抑制間充質干細胞分化為脂肪細胞的方法。

一種抑制間充質干細胞分化為脂肪細胞的方法，構建含有ICAM-1基因的重組逆轉錄病毒表達質粒，然后加入包裝質粒后共同轉染包裝細胞，收病毒上清并感染間充質干細胞，間充質干細胞中ICAM-1過表達抑制間充質干細胞分化為脂肪細胞；所述ICAM-1基因的DNA序列為SEQ?ID?NO:1所示核酸序列。

所述重組逆轉錄病毒表達質粒中原始的逆轉錄病毒表達質粒為MIGR1質粒。

所述包裝質粒為ECOS質粒。

所述包裝細胞為T293細胞。

所述間充質干細胞為人、小鼠、大鼠、兔、狗或猴間充質干細胞。

本發明分離方法操作簡單、方便實用，轉染間充質干細胞的效率高（可高表達ICAM-1達90%以上）、所得到的間充質干細胞體外增殖旺盛、可多次傳代（傳代培養50代后，仍然生長良好），并且具有極低地向脂肪細胞分化的能力。因此，本發明建立了穩定的抑制間充質干細胞分化為脂肪細胞的培養技術體系，為間充質干細胞的研究應用奠定了基礎。

附圖說明

圖1為MIGR1-ICAM-1逆轉錄病毒載體的構建結果；

圖1A為小鼠ICAM-1基因的PCR產物凝膠電泳結果：M:?DNA?Marker?IV；1:?ICAM-1基因；

圖1B為重組質粒pMD19-T-ICAM-1雙酶切產物凝膠電泳結果：M:?DNA?Marker?IV；1:?MIGR1雙酶切前；2:?MIGR1雙酶切后；3:?pMD19-T-ICAM-1雙酶切后；4:?pMD19-T-ICAM-1雙酶切前；

圖1C為重組逆轉錄病毒表達質粒MIGR1-ICAM-1雙酶切及PCR產物凝膠電泳結果：M:?DNA?Marker?IV；1:?MIGR1-ICAM-1雙酶切后；2:?MIGR1-ICAM-1雙酶切前；3:?質粒MIGR1-ICAM-1為模板的PCR。

圖2為高表達ICAM-1的MSCs細胞（C3H10T?1/2-?MIGR1-ICAM-1）的建立；

圖2A為MIGR1及MIGR1-ICAM-1病毒上清感染C3H10T?1/2細胞48h后熒光表達（標尺代表500μm）；