[發明專利]一種大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法

無效

• 申請號: 201310033918.1
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103091144A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 耿龍武;魯翠云;姜海峰;徐偉
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黑龍江水產研究所
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;C12N5/071
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 高會會

1.一種大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法，其特征在于大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法是按以下步驟進行的：

一、活體注射：用5～10ppm苯氧乙醇將大鱗鲃魚麻醉后稱重，第一次活體腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，劑量與體重的比為7～12μg∶1g，16～20h后第二次活體腹腔注射植物血球凝集素(PHA)，劑量與體重的比為5～10μg∶1g，作用4～6h后注射質量濃度為0.1％～0.2％的秋水仙素，劑量與體重的比為5～10μg∶1g，反應時間為2～4h；

二、取樣：將步驟一處理的大鱗鲃魚剪鰓，水中放血10～15min，然后取出頭腎于質量濃度為0.7％～0.9％的NaCl生理鹽水中洗滌，用手術剪剪碎至生理鹽水變渾濁為止，靜置3～5min后用吸管收集上層細胞懸液于離心管中，在轉速為1000～1500r/min的條件下離心5～10min，棄上清，收集細胞；

三、低滲：向步驟二收集的細胞中加入低滲液，用吸管吹打至細胞均勻分散后，室溫反應40～60min；其中低滲液由質量濃度為0.1％～0.5％的KCl溶液和質量濃度為0.1％～0.5％的檸檬酸鈉溶液按體積比為1∶1～2混合而成；

四、固定：將步驟三低滲的細胞在轉速為1000～2000r/min的條件下離心5～10min，留0.3～0.5mL的上清液吹打成細胞懸液后，加入卡諾氏固定液固定20～30min；

五、重復步驟四的操作1～2次后，在1000～1500r/min的轉速下離心5～10min，棄上清液，沉淀物用卡諾氏固定液吹打成細胞懸液后置于-18～-20℃下冷凍過夜；

六、冷滴片：把步驟五冷凍的細胞懸液離心后棄上清液，加入2～3mL的卡諾氏固定液混合均勻，取浸泡在冰水混合液中預冷的干凈載玻片，分散滴上2～3滴細胞懸液，立即將載玻片在酒精燈火焰上方過3～5次，使染色體分散和展開，然后于室溫下干燥；

七、染色：將步驟六干燥的染色體載玻片用體積分數為10％～15％的吉姆薩染色液染色30～50min，自來水沖洗，自然干燥后完成染色體標本制備，即得到大鱗鲃魚染色體。

2.根據權利要求1所述的一種大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法，其特征在于步驟二中在轉速為1000r/min的條件下離心5min。

3.根據權利要求1所述的一種大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法，其特征在于步驟四中在轉速為1000r/min的條件下離心5min。

4.根據權利要求1所述的一種大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法，其特征在于步驟四中加入卡諾氏固定液吹打成細胞懸液后固定20min。

5.根據權利要求1所述的一種大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法，其特征在于步驟五中在1000r/min的轉速下離心5min。

6.根據權利要求1所述的一種大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法，其特征在于步驟五中沉淀物用卡諾氏固定液吹打成細胞懸液后置于-18℃下冷凍過夜。

7.根據權利要求1所述的一種大鱗鲃魚腎細胞體內培養制備染色體的方法，其特征在于步驟七中用體積分數為10％的吉姆薩染色液染色30min。