[發明專利]絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液及其在制備誘導雜交竹抗病藥劑中的應用無效

申請號：	201310033858.3	申請日：	2013-01-29
公開（公告）號：	CN103088094A	公開（公告）日：	2013-05-08
發明（設計）人：	朱天輝;張麗娜;李姝江;韓珊;譙天敏	申請（專利權）人：	四川農業大學
主分類號：	C12P21/00	分類號：	C12P21/00;C07K1/30;C07K1/18;C07K1/16;A01N63/02;A01P3/00;A01P21/00
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摘要：
搜索關鍵詞：	絳紅霉菌 sp3 抗菌蛋白母液及其制備誘導雜交抗病藥劑中的應用
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及的是絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液及其在制備誘導雜交竹抗病藥劑中的應用。

背景技術

撐×綠雜交竹是南方重要的經濟用材竹，也是四川等地引種發展的主要經濟竹種之一。近年來，由絲孢綱真菌暗孢節菱孢菌[Arthrinium?phaeospermum?(Corda)?M.B.Ellis]引起的雜交竹梢枯病導致撐×綠雜交竹大面積枯死，造成巨大的經濟損失，極大地威脅著長江中上游地區退耕還林的進程和生態屏障的建設。目前主要采用化學防治和營林技術，而生物防治措施研究較少。化學防治雖是一種有效的防治手段，但存在病原菌抗藥性、環境與食品安全、藥害等許多實際問題，一些化學殺菌劑在許多發達國家和地區已嚴格限制使用。而與環境友好的生物農藥越來越受到人們的青睞，是未來農業可持續發展的重要組成部分。李姝江和譙天敏等從雜交竹健康植株分離到一株銅綠假單胞菌（Pseudomonas?aeruginosa）ZB27，用其菌懸液和代謝產物處理對雜交竹梢枯病有較好的防治效果，但銅綠假單胞菌為條件致病菌，作為生防菌劑在田間使用受到限制，而本發明涉及的絳紅褐鏈霉菌SP3(本申請人已于2012年09月27日申請中國專利，申請號為201210367119.3，公開號CN102864110A，發明名稱：絳紅褐鏈霉菌SP3菌株及其在紅豆杉土傳根病和紅豆杉促生上的應用)對雜交竹生防效果較好，但用其代謝產物—純抗菌蛋白作為誘導因子，誘導植物抗性，提高雜交竹免疫性尚無人報道。

誘導抗性，即利用生物或非生物因子激發植物的防衛基因，使植物產生局部的或系統的抗病性而達到防病的效果，在植物病害防治中具有重要的意義。其中，關于化學誘導因子誘導抗性的研究國內外報道很多。另外，利用生物因子誘導植物產生抗性的研究也較多，這些生物因子包括致病菌、弱毒小種、AM真菌、植物根圍促生細菌（PGPR）和放線菌等。隨著研究的深入，發現一些來源于微生物的誘導因子和微生物一樣可以誘導寄主植物產生防衛反應，尤其是誘導植保素的合成和積累。Thakkera等利用從Fusarium?oxysporum?f.?sp?cubense獲得的激發子處理香蕉根部，可引起香蕉葉片防御性相關酶的積累，能有效提高感病品種的抗性；Jung等發現從芽孢桿菌菌株中純化獲得的細菌素（class?Iid）可誘導大豆PAL、APX、SOD和PPO等活性的增加；Mao等從Alternaria?tenuissima的菌絲中純化得到耐熱酸性蛋白激發子PeaT1，能夠誘導煙草對TMV產生系統抗病性；李云鋒等利用從稻瘟病菌細胞壁中純化獲得的糖蛋白激發子CSBⅠ（分子量為102?kDa）接種水稻，可引起葉片內POD、PAL、LOX活性、綠原酸和木質素含量的顯著增加。蔣繼志等從31種微生物中篩選出了兩種放線菌源激發子，其中放線菌A?5295發酵液型激發子誘抗效果最高，達63.?97%，并推測發酵液中有效誘抗物質可能是蛋白質類、多糖類等物質。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供一種絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液及其在制備誘導雜交竹抗病藥劑中的應用。

本發明涉及的絳紅褐鏈霉菌SP3菌株，本申請人已于2012年09月27日申請中國專利，申請號為201210367119.3，公開號CN102864110A，發明名稱：絳紅褐鏈霉菌SP3菌株及其在紅豆杉土傳根病和紅豆杉促生上的應用。

本發明的技術方案如下：

一種絳紅褐鏈霉菌SP3抗菌蛋白母液，按照以下方法制備：

A1去菌發酵濾液的制備：

從新鮮培養的斜面菌種制備絳紅褐鏈霉菌SP3孢子懸浮液，調整孢子濃度為10⁸cfu/mL；然后以1%的接種量接入滅菌的發酵培養基中，于25℃、140r/min振蕩培養4d，發酵液于8000r/min離心15min，取上清液用0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾除菌，備用；

A2采用硫酸銨沉淀法提取抗菌物質，制備活性粗蛋白；利用55%飽和度的硫酸銨鹽析濃度對發酵液進行粗提取，得到的即為活性粗蛋白；

A3?純化抗菌蛋白，得到幾丁質結合抗菌蛋白母液：

A31??DE52離子交換層析；

A32?Sephadex?G-75凝膠過濾層析；?

A33?Sephadex?G-50凝膠過濾層析；