[發(fā)明專利]一種基于光場傳播的非標記三維顯微方法和裝置

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310033614.5
• 申請日: 2013-01-28
• 公開（公告）號: CN103148800A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 匡翠方;修鵬;劉旭;葛劍虹
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學
• 主分類號: G01B11/24
• 分類號: G01B11/24
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于光學超分辨顯微領(lǐng)域，尤其涉及一種基于光場傳播的非標記三維顯微方法和裝置。

背景技術(shù)

隨著科學技術(shù)的發(fā)展，人們不斷追求越來越小的尺寸結(jié)構(gòu)和越來越高的分辨能力，特別是在微電子、航空航天、納米加工、生命科學和材料工程等領(lǐng)域，對微小尺度結(jié)構(gòu)的要求日益迫。透過式干涉相位顯微技術(shù)的發(fā)展，為非標記條件下的顯微成像提供了支持。

由于樣品與周圍環(huán)境的折射率不同，光在透射樣品玻片過程中光的相位會受到樣品的調(diào)制，從而攜帶樣品的折射率和厚度信息，通過與參考光干涉的方法得到樣品折射率分布圖。2007年，Wonshik?Choi首次提出層析相位顯微鏡，即通過改變透射光角度，得到一系列角度相關(guān)的折射率分布圖，通過適當?shù)乃惴▽崿F(xiàn)三維重構(gòu)，實現(xiàn)更高精度的三維樣品圖。2011年他們對光路進行了修改，在犧牲一定程度分辨率的情況下，實現(xiàn)了。他們在2008年申請了相關(guān)專利，為實現(xiàn)生物樣品實時測量提供了保證，促進了光學干涉相位成像進入一個嶄新的發(fā)展階段。

干涉相位顯微術(shù)具有較高的高分辨率，在橫向方向的分辨率約為0.8μm，縱向方向約為1μm。顯微鏡的高分辨率不僅僅是由于光的衍射極限限制，樣品的不均勻性也是影響分辨率的重要因素。通過改變照明角度的方法，重構(gòu)三維圖像，能夠明顯的提高干涉相位顯微鏡的分辨能力，如果采用拍頻干涉法的話分辨率可以做到橫向0.5μm，縱向0.75μm，采用直接干涉的方法可以得到橫向0.6μm，縱向0.8μm的分辨率。很大程度上提高了干涉相位顯微鏡的分辨能力。

通過角度掃描的方法來實現(xiàn)三維重構(gòu)，由于要實現(xiàn)大范圍角度遍歷，成像速度較慢，不適合生物活動樣品的觀察。而且在已有的層析相位顯微鏡的光路中參考光路和樣品光路的不重合，這樣會引入一定的環(huán)境誤差，不利于分辨率的繼續(xù)提高，同時，目前的層析相位顯微鏡僅僅局限于一維掃描，這對分辨率的提高也存在著一定限制。

因此，必須提出一種新的層析相位方法，來實現(xiàn)較高的成像速度和共路測量，并且要實現(xiàn)二維掃描的便宜性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種基于光場傳播的非標記三維顯微方法和裝置，通過對光場傳播技術(shù)來實現(xiàn)相位檢測，有效提高了系統(tǒng)的成像速率。本發(fā)明結(jié)構(gòu)簡單，可以實現(xiàn)共路測量，很大程度上減少環(huán)境因素的影響，可用于非標記生物樣品的高精度檢測、測量等領(lǐng)域。

一種基于光場傳播的非標記三維顯微方法，包括以下幾個步驟：

1)將激光光束聚焦后投射到待測樣品上，并利用顯微物鏡收集帶有樣品信息的激光光束；

2)將帶有樣品信息的激光光束分成第一光束和第二光束，并通過第一圖像傳感器和第二圖像傳感器分別采集第一光束和第二光束的光強信息圖像；

3)改變激光光束入射到待測樣品上的角度，對待測樣品進行掃描，并利用顯微物鏡收集帶有樣品信息的激光光束，然后重復步驟2)；

4)通過計算機對所述的光強信息圖像進行計算分析得到相應(yīng)的相位遲滯分布圖，然后采用三維重構(gòu)算法得到三維圖像。

所述激光光束經(jīng)濾波和準直后轉(zhuǎn)換為平面波投射到待測樣品上。激光光束經(jīng)濾波和準直后得到高品質(zhì)的平面波，能提供整個系統(tǒng)的成像分辨率。

所述顯微物鏡為數(shù)值孔徑為1.4的浸油式顯微物鏡。待測樣品需要滴油浸沒以提高橫向分辨率，顯微物鏡同樣采用浸沒式高數(shù)值孔徑的型號，同時搭配與顯微物鏡配套的場鏡。

所述第一光束和第二光束的光路相互垂直。

本發(fā)明還提供了一種基于光場傳播的非標記三維顯微裝置，包括用于產(chǎn)生激光光束的光源，還包括：

沿所述激光光束光路依次布置掃描器、樣品臺、顯微物鏡和分光鏡；

用于采集所述分光鏡出射光束的光強信息圖像的第一圖像傳感器和第二圖像傳感器；

以及與所述掃描器、第一圖像傳感器和第二圖像傳感器連接的計算機。

本發(fā)明所采用的掃描器為二維掃描振鏡。

所述光源和掃描器之間設(shè)有沿所述激光光束光路依次布置的小孔光闌和準直透鏡。小孔光闌用于對激光光束進行濾波，準直透鏡用于對激光光束進行準直，激光光束經(jīng)濾波、準直后能提高激光質(zhì)量，得到高品質(zhì)的平面波，能提升整個系統(tǒng)的分辨率。

所述掃描器和樣品臺之間設(shè)有沿所述激光光束光路依次布置的掃描透鏡和會聚透鏡。為了保證光線在角度變化時光線入射到待測樣品上的位置不變，必須保證二維掃描振鏡的反射中心在掃描透鏡的前焦點處，待測樣品放置在會聚透鏡的后焦點處，且掃描透鏡的后焦面與會聚透鏡的前焦面重合。