[發明專利]光譜學測定在脂立方樣品中膜蛋白穩定性的方法

無效

• 申請號: 201310033473.7
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103115885A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 劉偉;許恒皓;尹欣;盧辰;高嵩;程斌
• 申請（專利權）人: 連云港脂立方生物醫藥研究所有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/64;G01N1/28
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 劉喜蓮

技術領域

本發明涉及蛋白質基因工程技術領域，具體涉及一種通過光譜學測定脂立方樣品中的膜蛋白的活性以和穩定性的方法。

背景技術

早在1960年研究者就已經證明，親水性和疏水性的兩性分子在水中可以形成很多形態各異結構的理論。1962年luzzati的研究組測定了層狀相的結構，也獲得了六角相的電子顯微結構。隨后不久，又用X射線技術測定了類脂立方相的結構。1968年luzzati與加拿大的研究專家對脂質-水體系（lipid-water?system）進行了X射線的研究，得到了脂質-水體系的隨脂質濃度和溫度變化的部分相圖。1980年larsson提出，立方液晶中無限循環排列的脂雙層膜非常類似于生物膜中的脂雙層膜。1990年Engbrom?S.及其同事根據脂質立方液晶的結構特點，提出可以將類脂立方液晶用作藥物載體。脂質立方相?(Lipidic?cubic?phase,?LCP)?應用于膜蛋白結晶最早是在1996年，Landau?&?Rosenbusch通過脂質立方相獲得了第一個完整的細菌視紫紅質蛋白的2.5埃的晶體結構。在此之后，通過脂質立方相結晶膜蛋白就成為一個很實用的技術，并被廣泛傳播。實踐證明，這項技術對于闡明膜蛋白的結構機制是至關重要的，近年來，通過LCP獲得了很多關鍵蛋白的結構信息，譬如，各種細菌視紫紅質蛋白以及第一個高分辨率的人源G蛋白偶聯受體（2-adrenergic?receptor）。?運用脂質立方相能成功獲得高分辨率膜蛋白晶體，主要歸結為以下兩個原因：第一，與使用去垢劑與蛋白形成微球的惡劣環境不同，脂質立方相提供了一個更加接近天然的類似生物膜的環境；第二，在脂質立方相中，晶體生長時蛋白分子是按照I型堆積方式堆積，也就是蛋白分子不僅通過親水部位相互作用堆積，也通過疏水部位相互接觸而堆積，從而使得晶體結構更加有序，所含的水更少。到目前為止，通過LCP獲得的晶體結構達102個，蛋白種類達22種，晶型27種。因此，我們可以看出LCP為結構生物學研究提供了一個強有力的工具，在未來膜蛋白結構生物學研究中將扮演著舉足輕重的角色。

在獲得更多的蛋白結晶并解析其結構的基礎上，我們可以來進行基于蛋白結構的藥物設計，從而更加有效快速的篩選潛在藥物，減少藥物研發的成本和周期，并且可以有效的提高藥物的療效和減少藥物的副作用。熱穩定性越高的蛋白，其相應結晶成功率也就越高。因此為了更好的用脂立方技術進行蛋白結晶實驗，篩選有前景的蛋白construct又是其中的重中之重。另外，脂立方主要的脂質和脂質添加劑，以及限定可能的沉淀劑和緩沖液的范圍，都有可能影響蛋白的熱穩定性。?

現有技術中，蛋白的熱穩定性測定辦法非常多，包括底物結合曲線，圓二色光譜，升溫曲線等等。然而這些技術都是基于蛋白在溶液中的情況，并不反映蛋白在脂立方樣品中的具體表現。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種方法設計合理、可操作性強、可以在脂立方樣品內直接測定膜蛋白的穩定性的方法。

本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種光譜學測定在脂立方樣品中膜蛋白穩定性的方法，其特點是，其步驟如下：

（1）表達和純化目標蛋白；在NCBI網站上輸入目標膜蛋白名稱搜索序列，得到目標膜蛋白的全長基因序列；將全長序列導入相關細胞表達系統，然后進行純化，得到純化后的膜蛋白溶液；

（2）將膜蛋白溶液混入脂立方樣品；

①將純甘油一油酸酯或者甘油一油酸酯與下述脂類分子中的一種組成的混合物從-20℃的冰箱取出中，加熱至37-40℃后形成液態；前述脂類分子選自1,2?-?二油酰-sn-甘油-3?-?磷酸膽堿，1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺，1,2-二油酰-sn-甘油基-3?-?磷脂酰甘油，1,2-二油酰-SN-甘油基-3-磷脂酰絲氨酸或者膽固醇；其中，純甘油一油酸酯占混合物質量的90%以上；

②將液態甘油一油酸酯或者混合物轉移到玻璃針管中冷卻至20-24℃，并立即與膜蛋白溶液混合得到膜蛋白溶液樣品，將膜蛋白溶液樣品推過注射器的連接器以形成均勻的脂立方樣品；脂立方樣品中膜蛋白的最終濃度為0.5-2.0毫克/毫升，脂立方樣品中水的重量百分比為38-42％；同時以不含前述膜蛋白的緩沖液作對照；

③當一個均勻和透明的脂立方樣品形成后，將50-70微升的脂立方樣品轉移到石英比色皿中，密封；在5600×g和18-22℃的條件下離心；

（3）膜蛋白在脂立方樣品中的穩定性測定；