[發明專利]一種用于水質生物毒性快速檢測的發光菌試紙及其制備方法

無效

• 申請號: 201310033421.X
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103105388A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 隋國棟;張金玲;聶曉冬;劉思秀
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術領域

本發明屬于生物分析檢測技術領域，具體涉及一種能夠快速現場檢測水體生物毒性的發光菌試紙，并提供了該試紙的制備方法。

背景技術

隨著工業化程度的升高以及各類化工產品污染水體事件的突發，各種化學物質數量猛增，給人類生存環境造成很大影響，迫切需要對日益增多的環境污染物進行急性毒性鑒定。傳統的化學分析方法能準確定量分析污染物中主要成分的含量，但不能直接而又及時地反映各種有毒物質對環境和生物的綜合影響。傳統的動物毒性實驗以哺乳類、魚類等為受試對象，雖然能反映毒物對生物的直接影響，但方法繁瑣，實驗周期長，不滿足水質急性毒性檢測的需求。針對傳統毒性檢測方法的不足，目前國內外研究者建立了各種各樣的生物實驗方法，包括微生物、藻、底棲軟體動物、浮游生物、魚等，用來監測環境污染物對水生生物的毒性，其中發光菌因其獨特的生理特性，與現代光電檢測手段完美匹配的特點而倍受關注。?

發光菌最特別的生理代謝特征是在其生長的一定時間內，能夠發射可見光，簡單來說，細菌發光可概括如下：?

細菌身體內可以合成一種酶，該酶可以催化還原型的黃素單核苷酸（FMNH₂）和長鏈脂肪醛（RCHO，至少含8個C）并在O₂的參與下發生氧化反應而放出光子。該氧化反應并不放熱，所以發光菌發出的是典型的“冷”光。

發光波長在490nm左右。這種發光過程極易受到外界條件的影響，凡是干擾或損害細菌呼吸或生理過程的任何因素都能使細菌發光強度發生變化。當有毒有害物質與發光菌接觸時，發光強度立即改變，并隨著毒物濃度的增加而發光減弱。利用發光菌遇到毒性物質即減弱發光這一特性，可以快速而又相對準確地測試出水體的生物急性毒性。

水凝膠（hydrogels）是一種親水性但不溶于水的高分子聚合物,是一類集吸水、保水、緩釋于一體并且發展迅速的功能高分子材料。水凝膠具有獨特的吸水、保水及仿生特性，因而被廣泛應用于工業、農業、醫藥和生物工程材料領域。水凝膠還具有優良生物相容性，親水性的水凝膠與被固定的酶或細胞的相互作用極弱，固定在水凝膠中的生物分子的活性能夠長時間保持。目前水凝膠已成功應用于固定哺乳動物細胞、DNA雜交分析等等。

但是，目前還未見將發光細菌固定在水凝膠中，用于快速水體生物毒性的的報道。

將發光細菌固定在水凝膠中，使得整個檢測過程更為簡便，測量結果更為穩定，由于細菌被固定在水凝膠中，因而對外界的條件變化適應性更好。此外由于試紙的便攜性，檢測時可將試紙直接投入待測水樣中，待反應時間結束后將試紙拿出然后進行發光度檢測。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠快速現場檢測水體生物毒性的發光菌試紙。該試紙同現行的檢測技術相比具有穩定、低價、便攜和靈敏性更高的特點。

本發明提供的能夠快速現場檢測水體生物毒性的發光菌試紙，以普通試紙材料為基底，通過水凝膠包裹發光菌，在紫外燈的照射下凝固為固態，從而將發光菌固定在試紙上而得到。該發光菌試紙放于-20oC冰箱保存，待用。

本發明提供的發光菌試紙的制備方法，具體步驟如下：

（a）準備試紙基底，裁剪成需要的尺寸；

（b）將發光菌菌粉和水凝膠按混合；

（c）將發光菌菌粉和水凝膠的混合物滴加于試紙基底上；???

（d）將試紙置于紫外燈下照射固定。

本發明提供的發光菌試紙的用于檢測的方法如下：將發光菌試紙放入2%的氯化鈉溶液進行復蘇，（約13--18分鐘）復蘇完畢后，將發光菌試紙投入待測水體，檢測發光菌試紙上發光菌的初始發光量和15分鐘（或30分鐘）后的發光量，對比得出抑光率，從而實現對該水體生物毒性的檢測。?

本發明中，用于凝固試紙上水凝膠和發光菌的紫外燈，可選用一般市面上售賣的便攜式手提紫外燈即可。用于檢測發光菌試紙上發光菌的發光量的裝置選用杭州綠潔公司的光子探測儀。

本發明中，水凝膠可選用聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA），并用2-羥基-2-甲基苯基苯酮（HMPP）作為光引發劑?，其中光引發劑為水凝膠體積的4%-6%，優選5%；菌種：費氏弧菌凍干粉（Vibrio?fischeri），市售的一般費氏弧菌凍干粉都可以滿足實驗要求。該實驗在一般常溫條件下即可進行。

本發明中，發光菌菌粉和水凝膠的混合物的用量比例范圍為：3~4mg菌粉和100uL的水凝膠混合。

本發明中，紫外燈下照射固定時間為8—15秒。

本發明提供的發光菌試紙，大小可為10cm×1cm。?