[發(fā)明專利]一種同步檢測十八種發(fā)熱伴出疹病原體的試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310033315.1
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103146841A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳勇;陳燕芬;南麗;黃迎彬
• 申請（專利權(quán)）人: 海爾施生物醫(yī)藥股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/04;C12R1/93;C12R1/35;C12R1/46;C12R1/42;C12R1/01
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及發(fā)熱伴出疹病原體的檢測試劑盒及其檢測方法，尤其是涉及一種基于GeXP多重基因表達遺傳分析系統(tǒng)的同步檢測十八種發(fā)熱伴出疹病原體的試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

發(fā)熱伴出疹性疾病是以發(fā)熱、出癥為主要臨床表現(xiàn)的疾病，包括麻疹、風疹和其它RFIs，常以暴發(fā)形式發(fā)生。現(xiàn)有的發(fā)熱伴出疹性疾病發(fā)病率高，尤對嬰幼兒人群危害更大，給人類健康與社會發(fā)展造成巨大威脅。該類疾病臨床癥狀一般表現(xiàn)較溫和，但嚴重的并發(fā)癥及其組織學相似性，使準確診斷病原體并進行辯證治療變得至關(guān)重要。目前對發(fā)熱伴出疹性疾病診斷如病原培養(yǎng)、血清學診斷和分子診斷等手段多數(shù)不夠準確高效，延誤治療甚至造成嚴重后果。因此亟需建立發(fā)熱伴出疹病原體快速高效的診斷方法。

目前，我國發(fā)熱伴出疹病原體的傳統(tǒng)檢測方法主要包括以下幾種：

（1）病原體檢查：即直接做影像及活組織檢查，或病原體分離培養(yǎng)，之后在顯微鏡、電鏡下觀察，做出診斷。優(yōu)點：成本低；對實驗室硬件要求低。缺點：1）耗時長：一般需3-5天或更長；2）診斷效率低：只能單菌純培養(yǎng)；對一些表型特征變異的病原體，用形態(tài)學經(jīng)驗很難辨別；此外，由于抗生素的濫用，細菌在檢測過程中生長受到抑制，導致假陰性的結(jié)果；3）工作量巨大：由于對每個抽檢樣品的每種菌都必須進行檢測，工作量非常巨大，特別是部分對培養(yǎng)環(huán)境要求較為苛刻的菌，更加大了檢測的工作量和難度。

（2）免疫學檢查：應(yīng)用最廣泛的是酶聯(lián)免疫技術(shù)（ELISA）:一般先用一抗與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，然后用通用的酶標記的二抗與一抗發(fā)生特異性結(jié)合，再將酶顯色，之后觀察結(jié)果。優(yōu)點：1）樣品通量較高：利用96孔酶標板，一塊平板可完成多個樣品的檢測；2）較敏感：利用酶聯(lián)的特性，可將原來的抗原信號放大；3）快捷：在時間上，比傳統(tǒng)的培養(yǎng)基微生物培養(yǎng)檢查法要縮短很多。但存在如下缺點：1）易出現(xiàn)假陽性：由于洗滌和抗原包被的操作，或由于抗原表面決定簇類似而發(fā)生交叉反應(yīng)，故易出現(xiàn)假陽性；2）耗時耗力：制作抗體是非常耗時耗力的工作；3）靈敏度不確定：實驗的靈敏度取決于抗體的好壞，而每個抗體的好壞不一，質(zhì)量難以控制；4）無法檢測多變異的病毒：變異性較快的病毒，如甲流病毒，存在多種亞型，并且經(jīng)常變異，變異導致抗體失效，無法檢測抗原。

（3）分子生物學——PCR檢測方法：目前經(jīng)常應(yīng)用的有實時熒光定量PCR、免疫PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR等，都是針對病原體的特異性靶基因進行檢測。其中，熒光定量PCR檢測方法最為成熟。熒光定量PCR技術(shù)的優(yōu)點：靈敏性高，并可精確定量，在對李氏桿菌、沙門氏菌、肉毒桿菌、大腸桿菌等的檢測中都取得了良好效果。2004年，中國發(fā)布了實施熒光定量PCR檢測禽流感H7亞型的國家標準。2009年，美國FDA批準了用熒光定量PCR檢測豬流感H1N1亞型的試劑盒。但也存在如下缺點：1）通量低：一次只能檢測一個病原成分，如需要檢測多種病原菌，就需要多臺PCR儀同時工作，效率低，周期長，對大批量的多種病原污染的樣品更是無從下手；2）成本相對較高：因一次只能檢測一個病原體，當一個樣品同時需要檢測多種病原菌時，必須一個一個檢測，成本相對增高。

（4）分子生物學——基因芯片法：基因芯片是通過微加工技術(shù)，將數(shù)以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段（基因探針），有規(guī)律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個二維DNA探針陣列，利用這類芯片與標記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。優(yōu)點：1）高通量并行檢測：當一個樣品同時需要檢測多種病原菌時，一次實驗即可得出全部結(jié)果；2）操作簡便快速：整個檢測只需4-8小時基本可以出結(jié)果；但也存在如下缺點：1）技術(shù)成本昂貴、復雜：每個樣品需要一個芯片，成本大于￥1000/樣品，不利于大規(guī)模推廣；2）探針的合成與固定比較復雜，特別是制作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟；3）不能精確定量，重復性差；4）靈敏度較低：芯片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴增，由于引物較多，容易自身產(chǎn)生二聚體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)，或由于Tm值不同，而導致擴增目的片段效率不同，進而影響檢測的靈敏度；5）由于芯片的種類較多，難以制定一個統(tǒng)一的質(zhì)量控制標準。