[發明專利]一種同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310033293.9
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103074451A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 吳勇;黃迎彬;南麗
• 申請（專利權）人: 海爾施生物醫藥股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/04;C12R1/93;C12R1/385;C12R1/22;C12R1/445;C12R1/46;C12R1/21;C12R1/32;C12R1/35;C12R1/01
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1.一種同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒，包括DEPC水、5×RT緩沖液、反轉錄引物、反轉錄酶、X溶液，10×PCR緩沖液、PCR引物、25mM氯化鎂溶液、DNA聚合酶和陽性對照品，其特征在于：所述的反轉錄引物包括以下表中九種呼吸道病原體的RT擴增引物及人RNA內參的RT擴增引物，所述的PCR引物包括以下表中余下十三種呼吸道病原體的正反向PCR擴增引物、人DNA內參的正反向PCR擴增引物、反應內參的正反向PCR擴增引物以及上述九種呼吸道病原體的PCR擴增引物及人RNA內參的PCR擴增引物，基因序列如下表所示：

2.根據權利要求1所述的一種同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒，其特征在于：所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA；反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向擴增引物帶熒光標記。

3.根據權利要求1所述的一種同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒，其特征在于：所述的陽性對照品連接有設計上述二十二種呼吸道病原體、RNA內參、DNA內參和反應內參的引物的基因保守序列的pMD18-T的克隆載體。

4.一種利用權利要求1-3中任一項所述的同步檢測二十二種呼吸道病原體的試劑盒的檢測呼吸道病原體的方法，其特征在于具體包括以下步驟：

（1）采集樣本并提取核酸

采集呼吸道感染患者的鼻咽拭子或痰液的分離培養物，從分離培養物中提取核酸；

（2）以患者核酸為模板進行RT反應

取5-20ng/ul的核酸樣品RNA5μL，DEPC水8μL，5×RT緩沖液4μL，RT引物溶液2μL，RT酶1μL混勻后加入到96孔樣品板上進行反轉錄，反應條件：48°C1分鐘；42°C60分鐘；95°C5分鐘；4°C直至收取RT產物；其中反轉錄引物溶液中各RT引物濃度均為500nM，所述的RT引物包括九種呼吸道病原體的RT擴增引物及人RNA內參的RT擴增引物，基因序列如序列表中SEQ?ID?NO.1～NO.10所示；

（3）以反轉錄產物為模板進行PCR反應

取RT產物8.6μL，10×PCR緩沖液2μL，25mM的氯化鎂4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶1.4μL，X溶液2μL混勻后加入到96孔樣品板上進行PCR反應，反應條件：95°C10分鐘；94°C30秒鐘，55°C30秒鐘，70°C1分鐘，循環35次；70°C1分鐘；4°C直至收取PCR產物；其中所述的X溶液為包括三磷酸脫氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向擴增引物序列為AGGTGACACTATAGAATA；反向擴增引物序列為GTACGACTCACTATAGGGA，所述的通用引物正向擴增引物帶熒光標記，PCR引物溶液中各PCR引物濃度均為200nM，所述的PCR引物包括余下十三種呼吸道病原體的正反向PCR擴增引物、人DNA內參的正反向PCR擴增引物、反應內參的正反向PCR擴增引物以及上述九種呼吸道病原體的PCR擴增引物及人RNA內參的PCR擴增引物，基因序列如序列表中SEQ?ID?NO.10～NO.50所示；

（4）GeXP遺傳分析儀毛細電泳分離樣品

取PCR產物1μL，GeXP遺傳分析儀配套的上樣緩沖液38.75μL，DNA標準品0.5μL，礦物油一滴混合均勻后加入到96孔分離液板上進行毛細電泳分離樣品，將GeXP遺傳分析儀的軟件獲得的圖譜與標準圖譜對比，判斷呼吸道病原體的種類。