[發明專利]一種促生抑菌解淀粉芽孢桿菌、調理劑制備方法及應用

有效

• 申請號: 201310032838.4
• 申請日: 2013-01-28
• 公開（公告）號: CN103074287A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 龐金梅;焦曉燕;武愛蓮;梁改梅
• 申請（專利權）人: 山西省農業科學院農業環境與資源研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/00;A01P3/00;A01C1/00;A01G13/00;C12R1/07
• 代理公司: 山西五維專利事務所(有限公司) 14105
• 代理人: 李印貴

技術領域

本發明屬于微生物在農業方面應用技術，主要涉及解淀粉芽孢桿菌調理劑制備方法及其應用。

背景技術

隨著設施農業的快速發展，連作和大量使用化肥農藥，使設施土壤養分失衡，土壤酸化，土傳病害頻繁發生，嚴重制約了設施生產的可持續發展。

目前，針對設施生產中土壤修復、植病防控已有多種應用微生物生產的制劑，如：CN100999667公開了一種設施菜地土壤改良劑及其制備方法與應用，強調作為土壤改良劑，菌劑中菌種的配比和固體菌劑載體的配比，菌劑單獨發酵活菌數僅為10億/ml。CN101948771A公開了防病促生植物內生解淀粉芽孢桿菌及其應用，強調在NYD培養液中可獲得菌數20～40億/ml發酵液，有2種抗菌物質，菌液稀釋50倍，處理水稻種子，對水稻惡苗病溫室防效達到84.6％以上。上述兩種制劑中，前者發酵液菌數偏低，用量和成本必然加大；后者處理種子用濃度也較高，用量和成本也不低。如果能將發酵菌液的活菌數和活性提高，減少使用量，降低生產成本，將大大節約能源和資源，利國利民。

發明內容

本發明的目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌制備的促生抑菌調理劑，該調理劑制備所用材料成本低廉，發酵產物效價高；并且產生多種促生抑菌物質。該調理劑可以在土壤和植物體內定殖；對多種植物土傳真菌性病害具有良好的防控效果和明顯的促生長作用。該調理劑的生產使廢棄物資源化，生產工藝簡單，無“三廢”排出；減少或替代化學農藥的使用，安全無毒，屬環境友好型制劑，符合生態農業和可持續農業發展的需求。

為實現上述本發明的目的，本發明的技術方案是：

1.本發明為一株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens.sp）Pb-4(T4,4),菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址:中國,北京市朝陽區北辰西路1號院3號,郵政編碼:100101，保藏編號為CGMCCN0.7155，保藏日期為2013年1月18日。

解淀粉芽孢桿菌的獲得過程與特征

解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4,4)獲得過程：該菌株是本發明人從太原市小店區永昌乳業奶牛養殖場的牛糞中分離獲得的。其分離過程：采集新鮮牛糞，稱取糞樣10g，放置在裝有玻璃珠的90ml無菌水中，劇烈振蕩10分鐘，靜置5分鐘。吸取牛糞稀釋液20ul,滴入馬鈴薯葡萄糖（PDA）瓊脂平板上，距離平板中央2.3cm處，3個直徑4mm無菌濾紙片上。然后在平板中央接種番茄枯萎病病原真菌。置28℃恒溫培養5d，逐日觀察記載抑菌效果。挑選抑菌明顯的濾紙周圍單菌落若干。按上述步驟，逐個驗證其抑菌效果。選抑菌效果最佳的菌株，反復純化后，保存于液體石蠟斜面試管中。

菌體形態特征：解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4,4)為革蘭氏陽性菌，好氧生長，桿狀，長為3.0μm～3.3μm，寬為1.0μm～1.2μm，內生芽孢，有鞭毛；在肉汁瓊脂培養基上形成乳白色菌落，皺褶，邊緣不整齊。經16SrDNA同源性系列分析：在GenBank數據庫中比對結果顯示，PB-4(T4,4)菌株屬于芽孢桿菌屬；與解淀粉芽孢桿菌聚為一群，具有98%、99%的相似性，確定PB-4(T4,4)菌株為解淀粉芽孢桿菌。

菌株生理生化反應：解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4,4)葡萄糖發酵實驗陽性、淀粉水解實驗陽性、明膠液化實驗陽性、V.P反應陽性、接觸酶反應陽性、甲基紅反應陽性、硝酸鹽還原實驗陽性、檸檬酸鹽利用陽性；可在pH值為6.0～9.0生長，適宜生長溫度為25～39℃。PB-4(T4,4)培養物，經121℃高壓滅菌10min和100℃恒溫水浴10min,相對未經熱處理的培養物，仍有80%以上的抑菌活性。

2.本發明提供解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4,4)調理劑的制備方法

（1）菌種活化：取液體石蠟中冷藏保存的解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4,4)，劃線接種于蛋白胨15g、酵母膏5g、葡萄糖5g、瓊脂斜面培養基（PYJ）上，28～36℃培養30～48h，連續轉管2次使菌種得到活化。備用。

（2）種子液培養：將活化菌種接種于裝有100mlPYJ培養液的250ml三角瓶中，30～35℃，150～200r/min，恒溫培養15～20h作為種子液。備用。