[發明專利]一種梅花鹿過氧化氫酶及其制備方法

無效

• 申請號: 201310031803.9
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103060344A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發明（設計）人: 林峻
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C12N15/53
• 分類號: C12N15/53;C12N9/08;C12N15/10;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種梅花鹿過氧化氫酶及其制備方法。

背景技術

過氧化氫酶（Hydrogen?Peroxidase）又稱觸酶（Catalase，CAT），是一類廣泛存在于動物、植物和微生物體內的末端氧化酶。真核生物的過氧化氫酶存在于紅細胞及某些組織內的過氧化體中，是過氧化物酶體的標志酶，約占過氧化物酶體酶總量的40%。哺乳動物組織中過氧化氫酶含量差異很大，以肝臟中含量最高，結締組織中含量最低。

過氧化氫酶的主要作用就是催化H₂O₂分解為H₂O和O₂，使H₂O₂不致于和O₂在鐵螯合物的作用下反應生成非常有害的-OH，從而使細胞免于遭受毒害，它是生物防御體系的關鍵酶之一。鑒于含有過氧化物酶的抗氧化復合物可用于治療，故認為過氧化氫酶也可用于治療氧化損傷疾病。

過氧化氫酶自1950年就開始應用在工業生產中，廣泛用于生物、醫藥、臨床醫學和食品領域中的某些分析測定，以及食品和乳制品工業、紡織工業、環保產業、制漿和造紙工業，在醫療器械的消毒、葡萄糖酸的生產等方面也有越來越多的應用。

目前商業化的動物源過氧化氫酶，主要以牛肝提取物為主。

梅花鹿為我國傳統的珍貴藥用動物，其產品在我國擁有悠久的藥用歷史。例如鹿茸，入藥已有2000多年的歷史，是一味名貴的滋補強壯的中藥。明代李時珍《本草綱目》中記載有“鹿茸能生津補髓，養血益陽，強筋健骨，益氣強志”。隨著科學技術的發展，進一步證明了鹿茸的藥理作用非常廣泛，具有調節機體新陳代謝、促進各種生理機能活動的作用。

目前，梅花鹿過氧化氫酶基因為未知序列，尚未見報道。克隆鹿源過氧化氫酶，并對其基因序列進行分析，并表達重組蛋白，無論是在工業化應用領域，還是探究其藥理價值，都具有重要意義。

發明內容

為獲得梅花鹿過氧化氫酶基因序列并表達其重組蛋白，本發明提供了一種梅花鹿過氧化氫酶及其制備方法，本發明成功的克隆得到梅花鹿過氧化氫酶基因，對其基因序列進行分析并表達了其重組蛋白，無論是在工業化應用領域，還是探究其藥理價值，都具有重要意義。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明首先提供了一種梅花鹿過氧化氫酶基因，所述梅花鹿過氧化氫酶基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

所述梅花鹿過氧化氫酶基因編碼的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

所述梅花鹿過氧化氫酶基因來源于梅花鹿。

本發明還提供了一種梅花鹿過氧化氫酶基因的克隆方法，其特征在于：所述梅花鹿過氧化氫酶基因的克隆方法如下：

（1）從新鮮梅花鹿肝臟中分離提取總RNA，將mRNA反轉錄為cDNA，再用PCR擴增；擴增結束后取PCR產物進行電泳檢測,并回收凝膠中的目標基因；

（2）將步驟（1）所得目標基因進行DNA序列測定，并對該目標基因進行序列和功能分析，最終確定梅花鹿過氧化氫酶基因；

步驟（1）中所述的從新鮮梅花鹿肝臟中分離提取總RNA的具體步驟如下：

A．從低溫中取出新鮮梅花鹿的肝臟組織，在液氮中將100mg組織碾磨成粉末，趁液氮尚未揮發光時，將粉末轉移到1.5ml?Ep管中，加入1.0ml的Trizol；

B．用1ml針筒，26-G號針頭抽吸勻漿液兩次以剪切基因組DNA，然后直接從針筒中將樣品轉移到無菌1.5ml?Ep管中；

C．加入200ml氯仿/異戊醇或氯仿，劇烈振蕩混勻30秒；所述氯仿/異戊醇的體積比為24∶1；

D．臺式離心機上，12,000rpm，室溫離心5?min；

E．轉移上清液到RNase-free?1.5ml?Ep管里，加入等體積異丙醇，室溫放置5?min；

F．臺式離心機上，12,000rpm，室溫離心5min；

G．小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失；

H．用70%酒精洗滌兩次，每次700μl，12,000rpm，室溫離心2min；

I．盡可能徹底地吸走上清，防止RNA沉淀丟失；

J．真空離心干燥3-5?min，或在室溫下使酒精完全揮發；

K．沉淀用30-50μl?DEPC-H₂O溶解。若沉淀難溶，68℃處理10?min；

L．凝膠電泳，確定RNA的完整性和污染情況；