[發(fā)明專利]一種同一切面多靶點蛋白免疫組化或免疫熒光標記的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310031801.X
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103105324A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設計）人: 林齊心;陳贊烽;熊玉林;王小亞
• 申請（專利權）人: 福州邁新生物技術開發(fā)有限公司
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發(fā)明屬于病理學領域，具體地，本發(fā)明涉及一種同一切面多靶點蛋白免疫組化或免疫熒光染色標記的方法。

背景技術

腫瘤標志物是腫瘤細胞在惡變、產生、發(fā)展、浸潤、轉移等過程中產生的與腫瘤細胞生長代謝密切相關的生理活性物質。它們往往僅見于胚胎組織，不存在極少存在于正常成人組織，但是在成人腫瘤組織中的含量大大超過在正常組織里的含量，通過檢測其在相應的細胞或組織中的存在及其濃度的變化，確定不知來源的轉移腫瘤的原發(fā)腫瘤，可進行腫瘤及其特性的診斷、分類，手術、化療、放療的監(jiān)測，同時給據治療前后指標的變化，進行評估患者的預后、治療效果。腫瘤標志物作為病理診斷的依據，對提高臨床腫瘤確診水平具有重要的參考價值。目前隨著科學的發(fā)展，腫瘤標志物的研究越來越深入，其對腫瘤細胞的生理意義得到逐步的揭示，同時，特異性強的新腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)，成為目前腫瘤研究中的一個重要的方向。

隨著研究的深入，腫瘤標志物的分類越來越精確，多項腫瘤標志物的聯(lián)合應用，可大大提高檢測的效率和準確率。目前組織的病理診斷標準主要是依據免疫組化技術，通過HE染色和一項腫瘤標志物的染色，進行腫瘤的診斷。鑒于免疫組化染色的顏色分類的缺陷，目前還無法實現(xiàn)在一張組織切片進行多標記物的鑒別。如果采用連續(xù)切片，在不同切片上進行腫瘤標志物的染色標記，雖然能實現(xiàn)多腫瘤標記物的識別，但是由于切片的自身厚度帶來的缺陷，使得同一位點的不同標記物染色可能處在不同的細胞上，無法完全準確的反應同一細胞內的不同標志物水平。

腫瘤干細胞（cancer?stem?cells，CSC）是腫瘤中具有自我更新能力并能產生異質性腫瘤細胞的細胞，是腫瘤難以治愈的重要原因。近年來對CSC研究的深入以及干細胞分離技術的進步，使人們對惡性腫瘤有了新的認識，并且發(fā)現(xiàn)CSC在腫瘤的發(fā)生、生長、浸潤、復發(fā)和轉移中起重要作用。通過分離純化CSCs，可以對其生物學特性如異質性腫瘤的演化、轉移和抗藥性機制等進行研究；鑒定CSCs?的基因圖譜，尋找?CSCs?的特異性靶位，研制新型針對CSCs?的藥物。對其特性研究的深入有助于闡明CSCs在腫瘤形成、?生長、?浸潤、復發(fā)和轉移中的作用機制，進而尋找徹底殺死?CSCs?的方法以達到最終治愈腫瘤的目的，為腫瘤的臨床治療展現(xiàn)一個全新視角，為腫瘤靶向治療找到新靶點，使治愈腫瘤成為可能。至今研究人員已先后從乳腺癌、腦腫瘤、前列腺癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌等惡性腫瘤中成功分離出腫瘤干細胞。腫瘤干細胞的成功分離使得腫瘤學領域的研究跨入CSCs研究時代。

腫瘤干細胞的分離鑒定主要賴于CSC特有的表面分子標記物的識別和區(qū)別于普通腫瘤細胞的生物學特性。腫瘤干細胞表面分子標記有兩類：一種是正常干細胞/祖細胞的標記。如?CD133，Nanog等。研究發(fā)現(xiàn)在人肝癌細胞株和原位肝癌組織中存在CD133+細胞。另一類CSC標記可能是與腫瘤的發(fā)展、轉移有關的標記，如?EpCAM、CD90⁺、CD45⁺。目前，通過抗體介導識別細胞表面特異受體的方法來實現(xiàn)分別腫瘤細胞、腫瘤干細胞的方法，主要有流式細胞儀細胞儀和免疫熒光法。

目前上述需要多抗原標記的技術還很難用免疫組化技術實現(xiàn)，目前同一切片上最多可進行兩種抗體的標記，即通過標記辣根酶標記產生棕色和標記堿性磷酸酶產生藍紫色來區(qū)分，但二者顏色的區(qū)分和技術操作上都有一定的困難，同時應用兩種不同酶標記抗體進行免疫組化染色的應用極少。而免疫組化技術是醫(yī)院病理科應用最成熟的技術，如何實現(xiàn)多抗原、多目標蛋白在切片的同一切面上進行免疫組化標記，對病理學的診斷的發(fā)展具有重要的作用。本發(fā)明提供了一種可在切片的同一切面上進行多靶點免疫組化標記的方法與技術。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種同一切面多靶點蛋白免疫組化或免疫熒光染色標記的方法，本發(fā)明方法實現(xiàn)了多抗原、多目標蛋白在切片的同一切面上進行免疫組化的染色標記，對病理學的診斷的發(fā)展具有重要的作用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術方案如下：

一種同一切面多靶點蛋白免疫組化或免疫熒光染色標記的方法，是對組織蠟塊進行切片時，取連續(xù)的兩張切片，采用載玻片撈片時，第一張切片的背面朝上，緊接第二張撈片時正面朝上，即用于染色的兩個組織切片表面屬同一切面。

對屬同一切面的兩張切片，分別進行不同靶點蛋白的免疫組化或免疫熒光染色，觀察時，取對應的同一區(qū)域的組織染色結果進行重合比較，實現(xiàn)同一細胞或組織位點多靶點蛋白的存在分析。