[發明專利]利用45Ca鑒別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法

無效

• 申請號: 201310031728.6
• 申請日: 2013-01-28
• 公開（公告）號: CN103114126A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 楊遠友;劉寧;廖家莉;劉志斌;楊毅;楊吉軍;唐軍
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12Q1/66
• 分類號: C12Q1/66;C12Q1/06;C12Q1/04
• 代理公司: 成都科海專利事務有限責任公司 51202
• 代理人: 呂建平

技術領域

本發明涉及轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣含量差異的鑒別，特別是涉及用⁴⁵Ca鑒別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣含量差異的方法。

背景技術

同位素示蹤技術是加入與目標元素性質幾乎完全相同的同位素，同位素與目標元素共同運行，通過同位素實現追蹤目標元素或被標記物質的運行或變化的一種方法。同位素可以是放射性同位素，也可以是穩定同位素。放射性同位素作為示蹤劑不僅靈敏度高，測量方法簡便易行，而且具有能準確定量，準確定位及符合所研究對象的生理條件等特點。同位素示蹤技術在生命科學中應用極其廣泛，可用于考察某種元素在生命體中吸收代謝過程，可利用同位素示蹤技術研究光合作用，可利用同位素標記核酸研究生物基因的功能等。此外，放射自顯影可以在組織或細胞水平上捕獲物質轉移動態，而放射免疫測定法則是將同位素引入抗原抗體反應的一種方法，該法比熒光抗體法更靈敏，也更容易定量。同位素示蹤技術現已成為研究生物現象不可缺少的方法。

鈣離子是細胞內的第二信使物質，Ca²⁺在植物耐熱信號轉導機制研究方面受到特別關注。研究表明，多種環境脅迫刺激都可能引起細胞內Ca²⁺的轉移運輸，說明鈣參與了植物的多種脅迫響應。張申宗、宰學明等采用Ca²⁺預處理顯著提高了其所研究的植物的耐熱性，因此細胞內自身鈣的含量是否與植物耐熱性存在某種關系，耐熱植物與普通植物自身所含鈣離子是否有差異，是非常值得研究的。

通過轉基因的方法培育耐熱植物以及與此相關的耐熱機制的研究是前沿性的研究課題，國內外都鮮有報道。TR1（ThermoResistance1）是四川大學生命科學院楊毅教授等采用基因工程技術發現的一個可提高植物及微生物耐熱性的基因，該基因經中科院、農科院等業內權威人士組成的鑒定委員會專家組認為，這是一種定位于膜上的新型耐熱基因，在高溫脅迫下，與對照組相比，轉入該基因的水稻株系的花粉活力、結實率、單株產量等指標均有顯著提高。

溫度是影響植物生長成熟最為重要的環境因素之一。隨著全球溫室氣體排放增加，溫室效應加劇，各種極端氣候頻繁發生，高溫已成為限制農作物生長的大問題。菜籽油是我國主要的食用油之一，研究培育對溫度有更好調控能力的高產油菜，對我國食用油安全至關重要。通過考察轉入耐熱基因后的油菜是否比普通油菜對鈣離子有更好的調控能力，研究耐熱基因在油菜中起到的抗逆性作用，對于培育對溫度有更好調控能力的高產油菜十分重要，但直到本發明完成之前，發明人未見有關這方面的研究報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用⁴⁵Ca鑒別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，為研究培育對溫度有更好調控能力的高產油菜奠定基礎。

本發明提供的利用⁴⁵Ca鑒別轉基因油菜和普通油菜原生質體吸收鈣差異的方法，主要包括以下步驟：

（1）油菜栽培：將普通油菜和轉基因TR1油菜種植在含有MS培養基的營養土中，于光照15-17小時/天，溫度23-25℃條件下培養45-55天，生長至真葉7-10片，分別取兩種油菜葉片提取原生質；

（2）原生質體提取：將上述培養的兩種油菜葉片切成0.4-0.6mm絲狀分別置于酶解液中，在24-26℃酶解8-10h，酶解后的細胞懸浮液經100-120目尼龍網過濾，所得濾液經離心分離除去上清液，所得沉淀加入WI原生質體養護液，經離心洗滌得到原生質體；

（3）原生質體活性鑒定：將步驟（2）提取到的兩種油菜的原生質體用熒光素酶FAD（Fluorescein?Diacetate）染色觀察，選取鏡檢細胞存活率＞90%的原生質體進行吸收鈣離子實驗；

（4）原生質體培養：將步驟（3）鏡檢符合要求的兩種油菜的原生質體分別置于含⁴⁵Ca示蹤劑的WI原生質體養護液中培養11~13h；

（5）原生質體鈣離子吸收量測定：將經步驟（4）培養得到的原生質體用濃度90~110mmol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）洗滌液洗滌除去原生質體表面的鈣，取0.1mL原生質體懸液經消解測量⁴⁵Ca的計數，取0.1mL原生質體懸液用于原生質體數目計數，將剩下的原生質體懸液離心分離，取0.1mL上清液用于上清液計數，通過下式分別計算兩種油菜的原生質體吸收鈣離子量q以鑒別兩種油菜原生質體吸收鈣的差異：