[發明專利]一種快速建立葡萄遺傳轉化再生體系的方法

無效

• 申請號: 201310031683.2
• 申請日: 2013-01-08
• 公開（公告）號: CN103444524A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 趙鳳霞;高相彬;王正平;宋學立;朱景偉
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院煙草研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于新植物技術領域，具體涉及葡萄轉基因育種技術領域。

背景技術

培育葡萄新品種、改善果實品質、提高植株抗性是葡萄科研工作者十分關注的問題，但是葡萄基因數量大且多呈雜合狀態，遺傳背景復雜，利用傳統的方法進行雜交育種，培育過程繁瑣，周期較長，成本較高，效率較低，通過雜交獲得優良品種的方法容易受到親本材料的限制，雜交過程常常帶入不良的經濟性狀，受到很大程度的制約。組織培養技術、分子生物學和基因工程技術的迅速發展，為葡萄新品種選育和品質改良研究開辟了新的途徑。利用轉基因手段培育葡萄優良品種，改善葡萄的農藝學性狀，同時提高果實產量具有十分廣闊的前景和極其重要的現實價值。

目前葡萄的遺傳轉化方法主要包括基因槍法和根癌農桿菌介導的Ti質粒法。基因槍法具有一次處理可使許多細胞轉化的優點，但是獲得單拷貝整合的植株比較困難，轉基因植株的遺傳特性較復雜，穩定性差，轉基因植株的表達困難，易出現沉默現象等。根癌農桿菌介導的方法轉化效率較高，可以導入的DNA片段較大，導入基因拷貝數低，表達效果較好，方法和使用的儀器簡單，費用較低，是目前轉化機理研究最清楚，使用最廣泛，技術最成熟的方法。

以愈傷組織為受體材料進行基因遺傳轉化研究具有很多優勢。第一，已分化的細胞均回復到脫分化的分生細胞水平，易于接受外源基因，轉化效率較高；第二，擴繁量大，獲得的轉化愈傷組織通過繼代擴繁培養，能夠分化出更多的轉化植株；第三，多種組織、器官均可誘導愈傷組織，外植體試材廣泛。

發明內容

本發明的目的在于克服已有技術的不足，利用根癌農桿菌介導的方法，使用葡萄花藥誘導胚性愈傷組織進行轉化，既結合了農桿菌轉化的優點，又克服了其他轉化方法周期長，轉化體少的缺點，通過本專利所描述的方法，以gfp為報告基因快速得到了釀酒葡萄品種雷司令的轉基因苗，提高了葡萄的轉基因育種效率。

本發明通過以下技術方案實現：

轉基因的方法：利用組織培養誘導釀酒葡萄品種雷司令花藥獲得的愈傷組織，經繼代培養篩選獲得胚性愈傷組織，以所獲得胚性愈傷組織作為受體，通過根癌農桿菌介導的方法，利用選擇培養基篩選獲得抗性愈傷組織，再生葡萄植株，經分子檢測及體式熒光顯微鏡觀察，獲得轉基因葡萄苗。根據該轉基因方法，其特征在于共培養前將農桿菌加入到抗性誘導培養基中進行活化，可顯著提高轉基因效率。OD₆₀₀＝1.0的菌液濃度侵染葡萄胚性愈傷組織能獲得較高的抗性愈傷率。抗性誘導培養基配方為：5g?L^-1牛肉浸膏、1g?L^-1酵母膏、5g?L^-1蛋白胨、5g?L^-1蔗糖、4g?L^-1MgSO₄·7H₂O、100μmol?L^-1乙酰丁香酮、50mg?L^-1卡那霉素、50mg?L^-1利福平，調節pH為5.2。繼代培養20天的胚性愈傷組織轉化效率最高。胚性愈傷組織和農桿菌在含有100μmol?L^-1乙酰丁香酮的液體共培養基中侵染處理20分鐘，可以順利脫除愈傷組織上附著的根癌農桿菌，而不影響胚性愈傷組織的生長，液體共培養培養基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg?L^-1鹽酸硫胺素、0.2mg?L^-1鹽酸吡哆醇、0.5mg?L^-1煙酸、150mg?L^-1肌醇、50mg?L^-1水解酪蛋白、10g?L^-1椰乳、5％蔗糖、100μmol?L^-1乙酰丁香酮、1mg?L^-1NOA、90g?L^-1甘露糖醇，pH為5.2。農桿菌和愈傷組織共培養溫度為28℃，固體共培養基成分為：MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg?L^-1鹽酸硫胺素、0.2mg?L^-1鹽酸吡哆醇、0.5mg?L^-1煙酸、150mg?L^-1肌醇、50mg?L^-1水解酪蛋白、10g?L^-1椰乳、5％蔗糖、100μmol?L^-1乙酰丁香酮、1mg?L^-1NOA和0.28％脫乙酰吉蘭糖膠；共培養三天后使用液體繼代培養基清洗，可顯著降低愈傷組織褐化程度，提高轉化效率，液體繼代培養基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg?L^-1鹽酸硫胺素、0.2mg?L^-1鹽酸吡哆醇、0.5mg?L^-1煙酸、150mg?L^-1肌醇、50mg?L^-1水解酪蛋白、10g?L^-1椰乳、5％蔗糖、100μmol?L^-1乙酰丁香酮、1mg?L^-1NOA、1g?L^-1頭孢霉素和100mg?L^-1二硫蘇糖醇；選擇培養基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg?L^-1鹽酸硫胺素、0.2mg?L^-1鹽酸吡哆醇、0.5mg?L^-1煙酸、150mg?L^-1肌醇、1.0mg?L^-1P-CPA，0.20mgL^-1TDZ，0.5mg?L^-1NOA，0.01mg?L^-1GA₃、50mg?L^-1水解酪蛋白、2.0mg?L^-1甘氨酸、.10g?L^-1椰乳、200mg?L^-1頭孢霉素、50mg?L^-1卡那霉素、5％蔗糖和0.28％脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2；分化培養基配方為MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg?L^-1鹽酸硫胺素、0.2mg?L^-1鹽酸吡哆醇、0.5mg?L^-1煙酸、150mg?L^-1肌醇、1.0mg?L^-1P-CPA，0.20mg?L^-1TDZ，0.5mg?L^-1NOA，0.01mg?L^-1GA3、5mg?L^-1的天冬氨酸、2.0mg?L^-1甘氨酸、10g?L^-1椰乳、5％蔗糖和0.28％脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2；所述生根培養基成分為1/2MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.1mg?L^-1鹽酸硫胺素、0.8mg?L^-1鹽酸吡哆醇、0.5mg?L^-1煙酸、100mg?L^-1肌醇、0.5mg?L^-1α-萘乙酸鈉、0.5mg?L^-1NOA、50mg?L^-1水解酪蛋白、2.0mg?L^-1甘氨酸、3％葡萄糖和0.28％脫乙酰吉蘭糖膠，pH6.2。