[發(fā)明專利]改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物及制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310031677.7
• 申請日: 2013-01-28
• 公開（公告）號: CN103087185A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邢金峰;張寧;王重夕
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/78;C07K1/107;C12N15/85;C12N15/87
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物及制備方法。

背景技術(shù)

基因治療是一種將外源基因?qū)肽康募毎⒂行П磉_，從而達到治病目的的治療方法。裸露的外源基因帶負電，難以滲入同樣帶負電的細胞膜且容易被機體或細胞降解，因而難以表達。所以基因治療的關(guān)鍵是選擇合適的基因載體及基因?qū)敕椒?，使目的基因能夠在靶細胞中獲得安全、高效、可控且穩(wěn)定的表達。

基因載體主要有病毒載體和非病毒載體兩類。1.病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但也有能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)、潛在的致瘤性、裝載容量有限、代價高等缺點，限制了它們的應(yīng)用。2.非病毒載體是目前公認可替代病毒載體的基因載體系統(tǒng)，它可避免諸如免疫原性、毒性等病毒載體的缺陷。具有低毒、低免疫反應(yīng)，外源基因隨機整合率低且攜帶基因大小類型不受限制等優(yōu)點。雖然非病毒載體安全性好，但存在轉(zhuǎn)染、整合效率低等缺點。

因此，如何研制出安全有效的、生物相容性好的基因藥物載體，如何提高非病毒性基因載體的靶向特異性和體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率，已經(jīng)是迫在眉睫的關(guān)鍵問題。

陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物載體屬于非病毒性基因載體。它們是利用結(jié)構(gòu)上帶正電的氨基靜電復(fù)合基因，再通過靜電作用結(jié)合細胞膜或通過攜帶的靶向配體與細胞膜上的帶負電荷的受體結(jié)合，通過內(nèi)吞、逃離內(nèi)體和胞質(zhì)轉(zhuǎn)運的方式表達目的基因。

但是，陽離子載體與基因組裝形成的復(fù)合物帶有過量正電荷，易與血清中帶負電的蛋白非特異性結(jié)合。當(dāng)靜脈注射后，復(fù)合物因聚集而被清除。另外，陽離子載體易與血液成分作用，會導(dǎo)致補體激活、血細胞凝結(jié)、血小板減少、白細胞減少等不良現(xiàn)象。因此，屏蔽掉陽離子載體-基因二元復(fù)合物表面過量的正電荷，是一種合理有效的解決途徑。目前主要有兩種方法：一種是將二元復(fù)合物表面PEG化，增強復(fù)合物的水溶性，在復(fù)合物周圍形成一層水分子膜，使得復(fù)合物與血液中帶負電的物質(zhì)減少接觸；另一種方法是將帶正電的二元復(fù)合物與帶負電的大分子通過靜電作用進行組裝，形成三元復(fù)合物，從而中和掉過量的正電荷。目前，將蛋白作為第三元物質(zhì)來屏蔽過量正電荷的方法得到越來越廣泛的研究。蛋白的來源非常豐富，而且具有良好生物相容性和生物可降解性。蛋白分子表面存在的氨基和羧基官能團易于共價改性，從而有效地與靶向配體偶合，增強載體的靶向性。因此采用蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物可高效安全地將基因遞送到靶向部位，從而實現(xiàn)基因治療，具有良好的研究前景。

另一方面，基因載體的轉(zhuǎn)染效率很大程度上決定于其逃離細胞內(nèi)涵體的能力，陽離子載體如PEI、PDMAEMA等具有大量未質(zhì)子化的叔胺和仲胺基團，能在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境下進一步質(zhì)子化，使內(nèi)涵體內(nèi)正電荷數(shù)目上升。與此同時，為平衡電荷，細胞質(zhì)內(nèi)負離子進入內(nèi)涵體，使內(nèi)涵體內(nèi)滲透壓上升，從而漲破內(nèi)涵體，釋放基因載體與基因。這就是聚陽離子基因載體的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改性蛋白。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種改性蛋白的制備方法。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種轉(zhuǎn)染效率高及生物相容性好的改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物的制備方法。

一種改性蛋白，是用式（I）或（II）表示：

其中：P為牛血清白蛋白、人血清白蛋白或膠原蛋白。

上述改性蛋白的制備方法，包括如下步驟：

（1）取400mg蛋白溶于40-80mL雙蒸水中溶解；

（2）將80-100mL乙胺或80-100mL濃度為2-4mg/mL的巰基乙胺水溶液滴加到步驟（1）制備的蛋白溶液中，調(diào)節(jié)pH至4.7-4.8；

（3）取80-100mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶于8-12mL雙蒸水中溶解，加入步驟（2）獲得的溶液中，在20-30℃水浴中反應(yīng)1-4h；

（4）將步驟（3）獲得的溶液用截止分子量3500～10000的透析袋在純水中透析2～14天；

（5）將步驟（4）獲得的透析產(chǎn)物冷凍干燥后得到改性蛋白。

所述蛋白優(yōu)選牛血清白蛋白、人血清白蛋白或膠原蛋白。

改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物，其特征是在陽離子載體-基因復(fù)合物上結(jié)合有改性蛋白。

所述陽離子載體優(yōu)選脂質(zhì)體2000、聚乙烯亞胺、聚乙烯吡咯烷酮接枝聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、聚賴氨酸、殼聚糖或聚甲基丙烯酸N,N二甲氨基乙酯。