[發(fā)明專利]CEACAMl蛋白磁粒的制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310030348.0
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103060361A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孟照輝;謝月輝;李玉葉;葉秋芳
• 申請（專利權(quán)）人: 昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K17/14;C12Q1/02;C12R1/36;C12R1/89
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 趙云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種人癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子1(CEACAMl)細胞外特定結(jié)構(gòu)域融合蛋白的表達、純化的方法和應(yīng)用，屬于分子生物學和應(yīng)用微生物學領(lǐng)域。

背景技術(shù)

癌胚抗原相關(guān)細胞粘附分子1(CEACAM1，NCBI?GenBank:NM_001712)是廣泛表達于中性粒細胞、巨噬細胞、上皮細胞及淋巴細胞表面的跨膜糖蛋白,屬癌胚抗原家族免疫球蛋白超家族粘附分子，其生物學功能包括促進血管的形成,調(diào)節(jié)血管的重塑，參與細胞凋亡的調(diào)控、促進腺體管腔的形成及調(diào)控胰島素的清除以維持細胞對胰島素的敏感性，同時CEACAM1也是致病微生物的粘著受體。淋病奈瑟氏菌(Neisseria?gonorrhoeae，NG)和腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria?meningitides，NM)通過其細胞膜表面的Opa(colony?opacity-associated)蛋白與粘膜上皮和內(nèi)皮細胞的CEACAM1受體結(jié)合，使其粘附并侵入細胞，以利于吞噬細胞吞噬。Opa蛋白是存在于NG和NM細胞壁上的膜蛋白，是這兩種致病微生物的主要侵襲蛋白。

微納米磁粒是通過化學反應(yīng)產(chǎn)生的以Fe3O4為核心的超磁性顆粒，其大小為200nm~1μm，具有無磁記憶性，表面積大的特點，可在其表面包裹自由羧基、羥基等基團，再通過偶聯(lián)劑與蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合，目前被用于核酸、蛋白質(zhì)、細胞的分離純化，腫瘤的定向靶診斷與治療。

目前的研究已經(jīng)克隆表達了CEACAM1細胞外的部分結(jié)構(gòu)域，并獲得純度較高的蛋白，但還沒有相應(yīng)制備CEACAMl蛋白磁粒復合物，用于淋病奈瑟氏菌的快速分離，以提高臨床診斷的敏感性和特異性的相關(guān)技術(shù)報道，也沒有CEACAM1與水體藍藻相互作用的報道。

微納米磁粒是后基因組時代生物大分子和細胞分離純化的有力武器，具有快速、特異性高、無毒、無污染、有利于機械自動化大樣本處理的新技術(shù)材料，可在其表面包被帶正電荷的硅、金屬鎳、及不同的蛋白質(zhì)如蛋白A等，可應(yīng)用于DNA、RNA、mRNA、抗體、蛋白質(zhì)、細胞、病毒和細菌的分離純化1-3。但該技術(shù)僅國外少數(shù)幾個公司(如挪威的Dynabeads)擁有且保密，售價很高，普及受限。

CEACAM1屬I型膜蛋白，廣泛存在于白細胞、內(nèi)皮細胞和上皮細胞的細胞膜上^4-6，該蛋白具有許多重要的生物學功能，如能抑制腫瘤及上皮細胞的生長和增殖^7，8，抑制T細胞和NK細胞的細胞毒性效應(yīng)^9，10，延遲粒細胞和單核細胞的凋亡¹¹，通過調(diào)控胰島素的清除而維持細胞對胰島素的敏感性^12，13。該蛋白分子量51KDa，由細胞外、跨膜區(qū)、胞質(zhì)內(nèi)三個結(jié)構(gòu)域組成，胞外結(jié)構(gòu)域與細胞間的同質(zhì)粘附(homotypic?adhesion)和異質(zhì)粘附(heterotypic?adhesion)有關(guān)^14-16，該結(jié)構(gòu)域通過剪切可激活caspase-1和-3參與細胞凋亡的調(diào)控¹⁷。胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域由C端的12~14個氨基酸組成，與細胞生長和信號傳導有關(guān)¹⁸。CEACAM1在表達時有不同的剪切體，它們的差異主要在胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，據(jù)此分為長短兩型，而胞外結(jié)構(gòu)域是較保守的^19，20。

奈瑟氏菌常寄生于動物粘膜表層，Opa是這該類革藍氏染色陰性細菌細胞壁上的粘附蛋白，在細菌粘著及侵入粘膜上皮和內(nèi)皮細胞中起重要作用，同時它也是中性粒細胞、巨噬細胞及CD4+T淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)劑^9，14，是該類細菌的主要抗原。Opa蛋白雖然像其它細菌抗原一樣，為逃避宿主免疫，其基因和氨基酸序列會發(fā)生突變，但在體外的研究中發(fā)現(xiàn)，在絕大部分突變體中，Opa蛋白仍能與CEACAM1結(jié)合^21-24，其突變區(qū)域與其它受體的結(jié)合有關(guān)，這說明Opa蛋白具有與宿主細胞膜多種受體結(jié)合的潛力，但無論怎樣突變，它仍然保持其與CEACAM1結(jié)合的最基本的功能。