[發明專利]一種快速降解甲基睪丸酮的基因工程菌及其用途

無效

• 申請號: 201310030113.1
• 申請日: 2013-01-28
• 公開（公告）號: CN103087957A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 李明堂;劉文叢;郝林琳;王呈玉
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/09;C02F3/34;C12R1/01;C02F101/34
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

1.一種快速降解甲基睪丸酮的基因工程菌，命名為：睪丸酮叢毛單胞菌Comamonas?Testosteroni?PK-4，該基因工程菌株已于2013年1月15日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC?No.7135。

2.獲得權利要求1所述快速降解甲基睪丸酮的基因工程菌的篩選方法，包括以下步驟完成：

（1）根據基因序列（GenBank?accession?No.?AHIL00000000），以3,17β-羥基類固醇脫氫酶基因為中心繪制基因圖譜，選取離3,17β-羥基類固醇脫氫酶基因較近的其它基因，分析其表達產生的蛋白質的性質，最終選取PhaR基因為目的基因；

（2）利用PCR技術從睪丸酮叢毛單胞菌基因組中獲得PhaR基因前300bp的突變基因片段，然后將該突變基因片段克隆至表達載體pCR2.1-TOPO上，獲得含有突變基因片段的表達載體pPK-8，再利用電穿孔導入法將pPK-8質粒整合到睪丸酮叢毛單胞菌的染色體基因組中，通過同源重組而使得染色體上的PhaR基因失活；

利用含有卡那霉素和氨芐青霉素的LB固體培養基篩選出陽性克隆，再通過PCR技術進行驗證，最終獲得PhaR基因敲除的目標菌株PK-4。

3.?根據權利要求2所述快速降解甲基睪丸酮的基因工程菌的篩選方法，其特征在于獲得PhaR基因前300bp的突變基因片段和驗證PhaR基因是否敲除的PCR技術的引物序列分別為：

正向引物5'-ATGACAAGAAAACAAAGAG-3'，

反向引物為5'-CTGCATGGCATGACCATA-3'；

正向引物5'-CATAAAGGACTTGCG-3'，

反向引物為5'-??ACGGCCGCCAGTGTG-3'。

4.?根據權利要求1所述的睪丸酮叢毛單胞菌基因工程菌降解去除養殖廢水中甲基睪丸酮的應用。