[發明專利]抗擬除蟲菊酯類農藥scFv的抗體基因及應用

有效

• 申請號: 201310029812.4
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103088033A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 杜欣軍;常繼晨;王碩
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C07K16/44;G01N33/53
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司 12209
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域和免疫學檢測領域，具體涉及一種抗擬除蟲菊酯類農藥scFv的抗體基因及應用。

背景技術

擬除蟲菊酯類(Pyrethroids)農藥是一類重要的仿生性殺蟲劑，過去一直被認為是一種安全的農藥。因其在體內具有容易被氧化酶系統降解，無蓄積性等優點，目前應用普遍、用量較大，占殺蟲劑總產量的20%，占整個殺蟲劑使用面積的25%。但最近有研究表明，大部分擬除蟲菊酯類農藥屬于環境激素類物質，具有免疫系統毒性、遺傳毒性和心血管毒性，嚴重影響哺乳類動物的正常生理活動，即使是低劑量，長期接觸也容易引起慢性疾病，有些還會有致畸、致癌、致突變等作用。因此，如何有效去除農產品中該農藥的殘留已成為人們廣泛關注的問題。

因為這類農藥殘留物的含量極微，因此要求高度靈敏的檢測技術。已報道的擬除蟲菊酯類農藥殘留量測定方法有氣相色譜（GC）法、酶聯免疫吸附（ELISA）等。GC法使用高靈敏度的電子捕獲檢測器，因而對樣品的凈化要求嚴格，并增加了分析流程時間。這就迫切需一種新的快速檢測的方法；普通的酶聯免疫法雖靈敏度高、樣品容量大，卻存在實驗動物需量大、飼養周期長，不同動物個體對農獸藥敏感程度不同，造成抗體差異大等問題；單克隆抗體作為第二代抗體，由于制備和篩選過程繁瑣，且對操作技術要求很高，克隆后的細胞遺傳容易不穩定等原因，不利于廣泛應用。

基因工程抗體的優勢表現在節省實驗動物及飼養時間、技術簡便、易于投入生產、遺傳信息具有可操作性。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種針對性強、穩定性高、制備方便的抗擬除蟲菊酯類農藥的scFv抗體及編碼該抗體的基因序列。

本發明的另一個目的是提供一種以擬除蟲菊酯類農藥為檢測目標的高豐度scFv抗體庫制備方法。

本發明還提供了一種高效的針對擬除蟲菊酯類農藥為目標的scFv抗體庫的篩選方法。

本發明實現目的的技術方案如下：

一種抗擬除蟲菊酯類農藥scFv的抗體基因的重鏈基因，所述重鏈基因的序列見序列1。

一種抗擬除蟲菊酯類農藥scFv的抗體基因的輕鏈基因，輕鏈基因的基因序列見序列2。

一種抗擬除蟲菊酯類農藥scFv的抗體基因，其包括重鏈基因和輕鏈基因，該基因由714個核苷酸組成，所述重鏈基因的序列見序列1，輕鏈基因的基因序列見序列2。

一種由抗擬除蟲菊酯類農藥scFv的抗體基因編碼的抗擬除蟲菊酯類農藥scFv的抗體。

而且，重鏈可變區由116個氨基酸組成，柔性鏈接區由15個氨基酸，輕鏈可變區由107個氨基酸組成。

由scFv抗體的氨基酸序列經特換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的scFv抗體。

含有抗擬除蟲菊酯類農藥scFv的抗體基因的載體。

含有抗擬除蟲菊酯類農藥scFv的抗體基因的基因工程菌。

抗擬除蟲菊酯類農藥scFv的抗體基因在擬除蟲菊酯類農藥檢測及制備抗擬除蟲菊酯scFv抗體中的應用。

抗擬除蟲菊酯類農藥scFv的抗體基因的基因工程菌在制備抗擬除蟲菊酯scFv抗體中的應用。

本發明的優點和積極效果如下：

本發明制備了抗擬除蟲菊酯類農藥的噬菌體展示的scFv抗體，基于PCR技術和噬菌體表面展示技術，本發明具有以下優點：

⑴本申請通過查閱大量NCBI數據設計了兼并引物，該引物能全面地覆蓋鼠源抗體重鏈和輕鏈的多樣性，尤其是輕鏈引物除了包括一般的kappa輕鏈引物，還包括了lambda輕鏈引物，以防止部分目的基因的丟失；

⑵本發明選用雜交瘤細胞作為制備抗擬除蟲菊酯類scFv抗體的基因來源，省去了免疫、飼養動物帶來的繁瑣，針對性更強，同時也免去了用小鼠脾臟免疫庫直接淘選所帶來的大量非目的抗體的干擾，減少了盲目性；

⑶因為噬菌體抗體稀釋液中包括一定比例的載體蛋白和封閉液成分，在淘選的親和吸附步驟中，本申請優化了噬菌體抗體稀釋緩沖液，以有利于篩選抗體更有針對性、排除載體蛋白、封閉液帶來的干擾；

⑷本申請的制備方法節省時間、技術簡便、易于發展下游生產、遺傳信息可操作且穩定。

附圖說明

圖1：以PBA-cDNA為模板，PCR擴增抗體重鏈、輕鏈圖。圖中：M：DL2000核酸分子量Marker，VH：抗體重鏈，VL：抗體輕鏈。