[發明專利]一種體外高效擴增動物細胞的培養液及其用途

無效

• 申請號: 201310029633.0
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103087977A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 洪敬欣;韓俊領;劉俊江;李茜;黃文敬
• 申請（專利權）人: 協和干細胞基因工程有限公司
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12N5/0775
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

技術領域

本發明屬于細胞與組織培養領域中的培養液配方，涉及一種低血清、組成成分明確的培養液，該培養液特別適用于體外擴增貼壁細胞。

技術背景

細胞培養基是維持體外細胞生存和生長增殖的基礎物質，也提供組織細胞營養和繁殖的生存環境。通過改善培養環境，可在較短時間內提高擴增倍數，減少擴增過程中的分化與老化。可分為天然培養基及合成培養基兩大類。體外培養細胞所需的營養物質與體內相同。目前市面上銷售的合成培養基RPMI1640、199等所含的氨基酸已足夠，但在使用合成培養基時，仍需加入一些天然成份，如人或動物的血清、血漿和胎汁等。動物細胞培養基的基本成分包括氨基酸、碳水化合物、無機鹽、緩沖系統、維生素等，所必需的溶液為平衡鹽溶液（常用的為Hanks液和Earle液）和PH調整液（3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO₃溶液、HEPES溶液）。

在一些較為復雜的培養液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術中常用的DMEM培養液，使用時還需要補加丙酮酸鈉和2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me對細胞生長有很重要的作用。有人認為它相當于胎牛血清，有直接刺激細胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氫基，其中一個重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘導細胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時避免過氧化物對培養細胞的損害。另一個重要作用是促進分裂原的反應和DNA合成，增加植物凝集素（PHA）對淋巴細胞的轉化作用，已廣泛應用于雜交瘤技術。

所謂的貼壁培養是指大多數動物細胞在離體培養條件下都需要附著在帶有適量正電荷的固體或半固體的表面上才能正常生長，并最終在附著表面擴展成單層。貼壁生長的細胞有接觸抑制的特性，一旦細胞形成單層，生長就會受到抑制，細胞產量有限。而懸浮培養是指少數懸浮生長型動物細胞在離體培養時不需要附著物，懸浮于培養液中即可良好生長。懸浮生長的細胞其培養和傳代都十分簡便。在動物體中只有少數種類的細胞適于懸浮培養。如果貼壁細胞長期不貼壁，有可能會死，或者活性降低。

目前較為常用的貼壁細胞培養基有以下幾種：RPMI1640、MEM、DMEM、DMEM/F12及無血清培養基。

（1）RPMI1640：RPMI1640是由Moor等研究成功的，最初為培養小鼠白血病細胞的需要而制備。開始的配方特別適合懸浮細胞的生長，主要針對淋巴細胞，后經幾次改良從RPMI1630、1634，而至RPMI1640。其組成較為簡單，但可以適應很多種類型細胞的生長。

（2）MEM：MEM培養基是由Eagle’s基礎培養基（BME）發展而來的，是將其中的氨基酸和維生素濃度調整至接近細胞質內含量水平的最低必需培養液（Eagle’s?minimum?essential?medium）。MEM是哺乳動物細胞的理想培養基，通常用于貼壁細胞的培養，通過對配方進行修正，可以用于其他類型細胞的培養，如無鈣MEM培養基可以用于懸浮細胞的培養，含有Hank’s鹽的MEM培養基可以用于二倍體細胞的培養。

（3）DMEM培養基是為小鼠成纖維細胞設計的，現在常用于貼壁細胞的培養。含各種氨基酸、維生素和葡萄糖。DMEM在MEM基礎上增加了各成分的用量，其氨基酸濃度是MEM的兩倍，維生素濃度是MEM的4倍，采用雙倍的HCO3-和CO2濃度起到更好的緩沖作用。最初的配方中葡萄糖含量為1.0g/L（低糖型），后來為了某些細胞的生長需要，將葡萄糖含量又調整為4.5g/L（高糖型）。高糖型有利于細胞停泊于一個位置生長，適合于高密度懸浮細胞的培養。低糖型適于生長慢、依賴性貼壁細胞的培養。有研究表明目前常用的含10％胎牛血清的低糖DMEM不利于維持間充質干細胞的干細胞特性，在多次傳代后發現其細胞粘附面積變大，鋪展開呈不規則型，增殖能力及分化潛能均降低，細胞老化明顯。

（4）DMEM/F12是由DMEM和F12按1∶1混合而成的。其中F12的成分和DMEM有所不同，它與F10相比含有更多的維生素，肌醇，氨基酸，與DMEM混和后成分更為多樣而均衡，營養成分豐富，且可以使用較少血清，或作為無血清培養基的基礎培養基，適于原代細胞的培養。