[發(fā)明專利]一種適合教學與科研使用的NK細胞活性檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310029288.0
• 申請日: 2013-01-27
• 公開（公告）號: CN103045712A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設計）人: 羅奇志;余平;龔拯;黃柏勝;王芙艷;霍治;王潔;黎明
• 申請（專利權）人: 羅奇志
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及一種NK細胞活性檢測方法。?

背景技術

自然殺傷細胞(natural?killer?cell，NK)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節(jié)有關，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發(fā)生。體外檢測NK細胞活性是了解NK細胞功能及其與某些疾病關系的一種重要手段，因而日益受到重視。目前把檢測機體外周血中的NK細胞活性作為反映機體細胞免疫功能的一項重要指標，并用來判斷某些疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后。醫(yī)學免疫學是一門實踐性很強的學科，因此，開設實驗課不僅可以驗證學生在理論課上學到的相關理論知識，而且還能訓練學生的基本實驗操作技能、培養(yǎng)其科學思維能力，進而提高學生的綜合素質。但由于NK細胞活性檢測實驗課時有限，要在有限的課時內使學生盡可能多的直觀的了解更多的免疫學知識及實驗操作技能，結合實際教學條件對NK細胞活性檢測實驗教學方法的改進顯得尤為必要。?

目前檢測NK細胞活性的方法有形態(tài)學法、同位素釋放法、乳酸脫氫酶釋放法、MTT比色法、熒光染料釋放法、流式細胞計數儀法等，這些方法各有一定的優(yōu)缺點。采取同位素釋放法檢測NK細胞的活性，雖然該法微量、客觀、敏感，但由于同位素的設備條件較高，且操作繁瑣及存在同位素防護和處理等問題，這樣就導致了實驗老師包攬了后續(xù)的實驗操作，因而其在學生的實驗教學中的應用受到限制。MTT比色法相對簡便，能同時處理大量樣本，并可定量檢測，避免同位素摻入法的不穩(wěn)定性和放射性污染，除廣泛用于細胞的活化、增殖以及藥物的細胞毒作用檢測外，也廣泛用于病毒感染細胞、腫瘤細胞及異常的自身細胞具有細胞毒作用的效應細胞活性測定，但是效、靶細胞孵育時間長，因細胞增殖速度不平衡造成NK細胞活性的非特異性增加而影響實驗結果。流式細胞計數儀法檢測NK細胞活性具有快速、敏感、所需效應細胞少的優(yōu)點，但是設備條件要求高，需要專業(yè)人員操作，目前難以在學生實驗室中開展。?

發(fā)明內容

一種適合教學與科研使用的NK細胞活性檢測方法，由淋巴細胞分離、NK細胞的制備、靶細胞的制備、細胞毒試驗步驟組成。其原理在于：NK細胞具有自然殺傷腫瘤細胞的活性，檢測NK細胞殺傷活性常用的敏感靶細胞如K562細胞。NK細胞通過與靶細胞的直接接觸而殺死靶細胞，噻唑藍（MTT）是水溶性淺黃色物質，經活細胞內線粒體代謝而生成藍紫色的甲臜結晶，沉積于細胞內和細胞周圍。在一定條件下甲臜生成量與活細胞的數量呈正比。通過測定OD值，可反映NK細胞對靶細胞的細胞毒性活性。?

淋巴細胞分離

1.?無菌抽取靜脈血2?mL或采用分離的脾細胞，去掉針頭注入含有肝素的無菌試管中搖勻，加入2?mL?PH7.2?Hank’s?液進行對倍稀釋，混勻。2.?用吸管吸取稀釋后的血液沿試管壁緩緩加到含有2?mL淋巴細胞分離液的試管中（血液:Hank’s液:淋巴細胞分離液的比例為1:1:1），使稀釋血液緩慢逐層疊加在分離液之上，并與分離液形成明顯的界面。3.?離心：2000r/min×20min，小心取出試管。4.?用平口吸管小心吸取中層呈白色霧狀的淋巴細胞層，用Hank’s溶液洗滌兩次，每次離心1500r/min×10min。5.?棄上清液，加RPMI-1640培養(yǎng)液1mL混勻，取少許進行細胞計數及活力測定。

在該步驟中可用毛細吸管輕輕吸取離心后中間層似白霧狀的外周血單個核細胞，置入15ml離心管中，用生理鹽水10ml洗滌細胞2次，代替用Hank’s液洗滌細胞，這樣獲得的細胞數明顯增多。?

細胞的制備

利用淋巴細胞分離液從抗凝血中分離出單個核細胞。經?RPMI-1640細胞培養(yǎng)液洗滌3次，置于細胞培養(yǎng)瓶中于25~37℃孵育1小時，以去除其他單核細胞（優(yōu)選為37℃）。然后調整細胞濃度為2×10⁶個/mL備用。因為單核細胞與NK細胞貼壁的速率不同，NK細胞貼壁的速率較慢，普通單核細胞先于NK細胞貼壁，此時培養(yǎng)液中絕大多數細胞都是NK細胞，所以采用25~37℃下孵育1小時的方法，能有效的去除大多數的普通單核細胞，該方法簡單高效，但該方法不能保證完全去除所有的其他單核細胞，所以只適合教學和科研，并不能用于臨床診斷。

靶細胞的制備

取細胞培養(yǎng)的對數生長期的K562細胞，經細胞培養(yǎng)液洗滌3次，調整細胞濃度為2×10⁵個/mL。K562細胞來源為人慢性髓原白血病細胞，該細胞系對NK細胞的殺傷作用極為敏感，常用來作為NK殺傷實驗的靶細胞。

細胞毒試驗