[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于構(gòu)建無(wú)篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310028228.7
• 申請(qǐng)日: 2013-01-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103966249A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂雪峰;談曉明;梁飛燕
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/74
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/74;C12N1/21;C12R1/01;C12R1/865
• 代理公司: 沈陽(yáng)科苑專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及藍(lán)細(xì)菌基因工程領(lǐng)域，具體而言是一種用于構(gòu)建無(wú)篩選標(biāo)簽藍(lán)細(xì)菌的載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

藍(lán)細(xì)菌廣泛分布于地球各種環(huán)境中，是一類(lèi)能夠進(jìn)行植物型光合作用的原核生物。1996年，日本Kazusa研究所完成了藍(lán)細(xì)菌集胞藻PCC6803全基因組測(cè)序工作，這是第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的光合生物；到目前為止，已經(jīng)有約40多種藍(lán)細(xì)菌基因組被測(cè)序完成。另外，由于藍(lán)細(xì)菌具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于培養(yǎng)、生長(zhǎng)相對(duì)迅速、遺傳操作簡(jiǎn)單方便等優(yōu)勢(shì)，包括集胞藻PCC6803、聚球藻PCC7942和魚(yú)腥藻PCC7120在內(nèi)的一些藍(lán)細(xì)菌菌株，成為光合作用、晝夜節(jié)律和固氮機(jī)理等研究的重要模式生物。

近年來(lái)，在能源和環(huán)境危機(jī)的背景下，基于生物質(zhì)資源的通過(guò)生物或化學(xué)轉(zhuǎn)化制備生物燃料的研究再次成為研究熱點(diǎn)。而藍(lán)細(xì)菌由于具有高效的光合作用能力、清晰的遺傳背景、簡(jiǎn)單方便的遺傳操作體系等優(yōu)勢(shì)，又被改造成為新一代光合能源微生物系統(tǒng)（Angermayr,S.A.,et al.(2009).“Energy biotechnology with cyanobacteria”,Curr OpinBiotechnol20(3):257-263.），用于合成各種生物燃料分子，如乙醇（Dexter,J.and Fu,P.(2009).“Metabolic engineering ofcyanobacteria for ethanol production”,Energy & EnvironmentalScience2(8):857-864.；Gao,Z.,H.Zhao,et al.(2012).″Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide ingenetically engineered cyanobacteria.″Energy & EnvironmentalScience5(12):9857-9865.）、正丁醇（Lan,E.I.and J.C.Liao(2012).″ATP drives direct photosynthetic production of 1-butanol incyanobacteria.″Proc Natl Acad Sci U S A109(16):6018-6023.）、異丁醇（Atsumi,S.,et al.(2009).“Direct photosyntheticrecycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde”,Nat.Biotechnol.27:1177-1180.）、脂肪醇（Tan,X.,L.Yao,et al.(2011).″Photosynthesis driven conversion of carbon dioxide to fattyalcohols and hydrocarbons in cyanobacteria.Metab Eng13(2):169-176.）、脂肪酸（Liu,X.,J.Sheng,et al.(2011).″Fatty acidproduction in genetically modified cyanobacteria.″Proc Natl AcadSci U S A108(17):6899-6904.）和脂肪烴（Schirmer,A.,M.A.Rude,et al.(2010).″Microbial biosynthesis of alkanes.″Science329(5991):559-562.）等。自2009年以來(lái)，相關(guān)研究證明了基因工程藍(lán)細(xì)菌合成生物燃料的可能性和巨大應(yīng)用潛力，也引起了國(guó)際上學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的高度關(guān)注。不過(guò)，產(chǎn)品產(chǎn)率不高以及由此引起的生產(chǎn)成本過(guò)高，又成為限制了基因工程藍(lán)細(xì)菌合成生物燃料路線產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的主要瓶頸問(wèn)題。

為了不斷提高藍(lán)細(xì)菌合成生物燃料的產(chǎn)量，對(duì)藍(lán)細(xì)菌基因組系統(tǒng)地遺傳改造工作就顯得十分重要。傳統(tǒng)的藍(lán)細(xì)菌遺傳操作手段多通過(guò)同源重組的方式將篩選標(biāo)簽（多為抗性篩選標(biāo)簽）插入待改造基因位點(diǎn)中或置換其部分編碼序列。這種遺傳改造方式依賴(lài)于可用的抗性篩選標(biāo)簽數(shù)目，已經(jīng)不能滿足多基因位點(diǎn)（3個(gè)以上）乃至基因組范圍的遺傳改造工作。因此，開(kāi)發(fā)一種能夠在藍(lán)細(xì)菌中切除篩選標(biāo)簽，構(gòu)建無(wú)篩選標(biāo)簽突變株的方法，對(duì)于藍(lán)細(xì)菌系統(tǒng)地遺傳改造工作，和基因工程藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)生物燃料研究具有重要的意義。