[發明專利]鱉甲DNA檢測試劑盒及鑒定方法

無效

• 申請號: 201310027918.0
• 申請日: 2013-01-14
• 公開（公告）號: CN103074433A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 李明成;苑廣信;張麗華;夏薇;王冰梅
• 申請（專利權）人: 吉林市雷博科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及中藥材鑒定技術，具體地說是一種鱉甲DNA檢測試劑盒及鑒定方法。

背景技術

鱉甲為鱉科的動物鱉(Trionyx?sinensis?Wiegamann)的背甲，又名：別甲、團甲殼、上甲、王八蓋子、鱉殼、鱉蓋子、水魚殼等。其原動物為中華鱉，俗稱團魚、甲魚、王八等，屬于爬行綱(Repitlia)；龜鱉目(Testudinata)；鱉科(Tironychidae)；鱉屬(Peodiscus)。在我國除西藏、青海及新疆以外其他地區均有分布，以長江流域和華南地區最為多見。我國中華鱉養殖產量居世界之首，但20世紀90年代以來，大量境外走私鱉涌入多我國，加上各養殖場相互之間引種、倒種極不規范，不注重培育品種，嚴重危害了中華鱉的種質資源，種質是產業的源頭，影響到鱉甲的資源，影響到鱉甲的用藥。

鱉甲性味咸、微寒，歸肝、腎經。始載于《神農本草經》，列為中品。鱉甲中含有多種成分，主要含有動物膠，角蛋白，碘質，維生素D，磷酸鈣，鱉甲多糖，多種氨基酸和多種微量元素等。豐富的成分使鱉甲的藥用價值很高。具有滋陰潛陽，退熱除蒸，軟堅散結等功能，用于陰虛發熱，骨蒸勞熱，陰虛陽亢，頭暈目眩，虛風內動，手足瘈疭，經閉，癥瘕，久瘧瘧母。為常用中藥之一，在臨床應用廣泛，除臨床的配方使用外，尚在復方鱉甲軟肝片、人參鱉甲煎丸、參桂鹿茸丸等數種中成藥中應用。《中國藥典》(2010年，一部)中的鑒別方法為：性狀鑒別和浸出物鑒別。文獻中尚有顯微鑒別、理化鑒別、光譜鑒別、色譜鑒別、生化鑒別等，但這些方法尚不能對鱉甲進行快速、有效的鑒別。

分子遺傳標記技術開始與中藥領域滲透，并快速融合、發展，其中DNA指紋圖譜在中藥材(除礦物藥外)的鑒定方面具有專屬性強，準確性高，重復性好等優點，從分子水平解決了以前中藥鑒定中宏觀鑒定水平上的不完善。現代分子生物學在中藥的質量控制領域逐步擴大，方法逐漸完善，大大加快了中藥現代化的進程。

線粒體是存在于真核細胞內的一種細胞器，線粒體DNA(mitochondrial?DNA，mtDNA)是一共價閉合的雙鏈環狀的遺傳物質，具有分子量小、結構簡單、易于分離、拷貝數高、突變率高、進化速度快、母性遺傳、無組織特異性、高保守性等特點。其中細胞色素b(cytochrome?b，cyt?b)基因和細胞色素C氧化酶亞基I(cytochrome?c?oxidase?subunit?I，CO?I)基因存在于所有動物中，進化速度適中，較短的一個片段就能包含從種內到種間信息，且其DNA序列很少存在插入和缺失，能夠保證足夠交異，是分析種內和近緣種間遺傳多樣性和進化關系的適當的DNA片段，可應用于生物的分類、系統發育和遺傳多樣性的研究。這兩個片段的基因可被作為動物中物種鑒定標記進行研究，因此，以線粒體DNA分子特征為遺傳標記的中藥鑒定更為準確、可靠。

我們依托吉林省科技廳(2008年1月立項)和吉林省教育廳資助課題(2010年1月立項)：《中藥DNA指紋檢測試劑盒的研究與開發》(2012年5月吉林省科技廳鑒定成果)，基于線粒體DNA建立動物中藥材的DNA指紋特征，成功開發出貂心、鹿鞭和鹿茸三種中藥材DNA鑒定試劑盒。

貂心屬細貴藥材，是國家藥監局局標準(原衛生部部頒標準)利心丸中的主藥。目前，國家標準中尚無貂心的法定鑒別方法，對貂心的成分研究及鑒別國內外文獻中也未見報道，常用中藥材鑒別方法無法區別貂心與易混動物的心臟，故給貂心及其制劑的質量控制帶來了很大困難。課題組在發現貂心線粒體DNA的全部基因組前提下，利用貂心mtDNA獨特的優勢，應用DNA擴增技術及測序技術研究貂心線粒體DNA的基因組部分序列，設計的寡核苷酸片段可特異鑒定雞心、鴨心、鵝心和兔心，成功發明了一種簡便、快速、特異的鑒定貂心專利技術(貂心DNA檢測試劑盒及鑒定方法，發明專利：ZL200810051643.3；2011.4授權)。相關成果發表在吉林大學學報《貂組織線粒體DNA及細胞色素b鑒定及特征》[2008，34(5)：790-793]，中國藥學雜志《水貂心肌線粒體mtDNA鑒定及RFLP特征》[2012，4(3)：182-185]。