[發(fā)明專利]一種在發(fā)酵過程中測(cè)定免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310027666.1
• 申請(qǐng)日: 2013-01-15
• 公開（公告）號(hào): CN103217490A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱保國;彭育才;楊嘉明
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 珠海市麗珠單抗生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 劉丹妮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明提供了一種在細(xì)胞培養(yǎng)過程中測(cè)定免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況的方法。同時(shí)，本發(fā)明也提供了測(cè)定免疫球蛋白發(fā)酵液樣品的糖基化和末端修飾情況試劑盒。?

背景技術(shù)

近十年來，單克隆抗體在生物醫(yī)藥界、乃至整個(gè)醫(yī)藥行業(yè)里取得重大的成功和巨大的發(fā)展。與傳統(tǒng)小分子藥物相比，單克隆抗體具有特異性強(qiáng)，療效顯著，副作用小，用量少等優(yōu)點(diǎn)。就藥物分子特性而言，抗體具有更大的不均一性。抗體的這一特性是由多種因素引起的，翻譯后修飾是其中最重要的內(nèi)在因素。常見的抗體翻譯后修飾包括糖基化，N端焦谷氨酸化，C端脫賴氨酸，脫酰胺，氧化，異構(gòu)化等。在抗體藥物研發(fā)的多個(gè)環(huán)節(jié)，如分子鑒定、工藝開發(fā)、質(zhì)量監(jiān)控等，均需要對(duì)翻譯后修飾進(jìn)行檢測(cè)分析。?

抗體IgG糖基化發(fā)生在重鏈Fc區(qū)的天冬酰胺，屬N-糖基化，是抗體的重要結(jié)構(gòu)組成。IgG糖鏈的核心單元由兩個(gè)N-乙酰葡萄糖胺和三個(gè)甘露糖的雙叉結(jié)構(gòu)連接組成，根據(jù)末端半乳糖、核心巖藻糖、末端唾液酸等的差異，可以組成多種不同的糖鏈結(jié)構(gòu)。IgG的糖基化是不均一的，表現(xiàn)為不同的糖型和含量。糖基化差異可以影響抗體的生物學(xué)活性和藥代特征，如CDC、ADCC、體內(nèi)清除半衰期等。?

抗體IgG的N端氨基酸為谷氨酰胺時(shí)，容易發(fā)生環(huán)化反應(yīng)而生成焦谷氨酸(pyroglutamic?acid，pyroE)。此反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行，也可以在酶催化條件下進(jìn)行。在抗體IgG分子的C端，則容易發(fā)生脫賴氨酸(-K)。在大部分情況下，兩者對(duì)抗體的生物活性沒有影響，但亦有報(bào)道指某些抗體的N端焦谷氨酸化可能會(huì)影響其與抗原的結(jié)合力。此外，N端的谷氨酰胺焦谷氨酸化和C端脫賴氨酸均會(huì)影響抗體的電荷分布，而電荷特性是抗體質(zhì)量監(jiān)控的重要指標(biāo)之一。?

因此，建立快速檢測(cè)抗體IgG糖基化和末端修飾的分析方法在抗體研發(fā)中具有重要意義。目前，本領(lǐng)域一般對(duì)糖基化和末端修飾單獨(dú)進(jìn)行檢測(cè)。酶解熒光標(biāo)記法是IgG1糖基化測(cè)定的經(jīng)典定量方法，但樣品處理過程相當(dāng)復(fù)雜，耗時(shí)長，而且需要樣品量大；也有使用質(zhì)譜測(cè)定IgG酶解片段進(jìn)行糖基化分析，如papain酶和IdeS酶等，但這些方法都存在一些不足，如酶切位點(diǎn)選擇性不強(qiáng)，或成本過高，或樣品處理復(fù)雜等，不適宜常規(guī)或工藝開發(fā)樣品的批量檢測(cè)。應(yīng)用LC-MS進(jìn)行肽圖分析理論上可以同時(shí)檢測(cè)抗體的糖基化和末端修飾，但含糖多肽的分離、測(cè)定和數(shù)據(jù)分析存在諸多技術(shù)難點(diǎn)，不適用于糖基化定量分析，而且樣品處理過程復(fù)雜，耗時(shí)長，酶切過程也可能對(duì)抗體原有末端修飾產(chǎn)生影響。在蛋白發(fā)酵過程中，需要對(duì)發(fā)酵液中蛋白的純度進(jìn)行隨時(shí)檢測(cè)，以更好地控制發(fā)酵過程，但是檢測(cè)需用樣品量大，檢測(cè)耗時(shí)長仍是目前最大的問題。因此，目前仍未有適用于抗體研發(fā)的對(duì)IgG的糖基化和末端修飾同時(shí)進(jìn)行快速測(cè)定的報(bào)道。?

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種在細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗體過程中同時(shí)測(cè)定免疫球蛋白(即抗體)的糖基化和末端修飾情況的方法，該方法能夠同時(shí)、快速地對(duì)發(fā)酵液中的免疫球蛋白糖基化、N端焦谷氨酸化和C端脫賴氨酸進(jìn)行測(cè)定。?

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供測(cè)定免疫球蛋白發(fā)酵液樣品的糖基化和末端修飾情況的試劑盒。?

本發(fā)明提供一種在細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗體過程中同時(shí)測(cè)定免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況的方法，所述方法包括以下步驟：?

1)使用親和色譜(Protein?A)初步純化免疫球蛋白，并使用超濾離心裝置濃縮樣品；?

2)使步驟1)中濃縮后的免疫球蛋白經(jīng)變性劑變性后，使用還原劑還原，從而拆分輕鏈和重鏈；?

3)使用反相超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈；?

4)使用質(zhì)譜測(cè)定步驟3)中獲得的輕鏈和重鏈的分子量；以及?

5)分析步驟3)中的色譜數(shù)據(jù)和步驟4)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，從而測(cè)定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況。?

其中，所述免疫球蛋白優(yōu)選為人免疫球蛋白，優(yōu)選為人免疫球蛋白IgG，進(jìn)一步優(yōu)選為人免疫球蛋白IgG1和IgG2亞型。?

并且，所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況優(yōu)選包括免疫球蛋白的輕鏈N端焦谷氨酸化，以及重鏈的天冬酰胺糖基化和N端焦谷氨酸化、C端脫賴氨酸。?

在本發(fā)明提供的測(cè)定方法中，所述步驟1)中使用超濾離心裝置濃縮樣品至1-5mg/mL，使用的超濾離心管截留樣品分子量為10K。?