[發(fā)明專利]一種油菜黃單胞菌致病變種的熒光PCR快速檢測引物及試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310027570.5
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103114136A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設計）人: 鄭媛
• 申請（專利權）人: 鄭媛
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種油菜黃單胞菌致病變種的熒光PCR快速檢測引物及包含該引物的試劑盒。

背景技術

油菜黃單胞菌木薯致病變種是油菜黃單胞菌的一種致病變種，是木薯作物最為嚴重的侵染病害，該病不僅在熱帶地區(qū)的非洲、中北美洲國家肆虐流行，給當?shù)啬臼砩a(chǎn)多次造成無法挽回的損失，也隨著國外優(yōu)質品種引種，伴隨著這些繁殖材料的定植和育種推廣，傳播入侵至我國。并逐步擴大危害范圍，危害趨勢愈演愈烈，危害后果更趨嚴重。目前，在我國廣西、廣東、海南等主要木薯產(chǎn)區(qū)，在該地區(qū)固有的熱帶風暴的推動下，在特有的地形、栽培屏障、溫濕度等環(huán)境因子的作用下，病原微生物和植物病原組織材料、土壤隨風或雨水飄移，在空中、地面被氣流、水流沖往不同方向和不同距離的其他種植地點，侵染該地健康植株，造成疫情的新的爆發(fā)和流行。該病危害面積大，侵染致死率高，海南儋州、廣西北海、象州及鄰近的泰國都已有該病的發(fā)病報道

油菜黃單胞菌木薯致病變種的傳統(tǒng)檢測與鑒定方法主要為病菌培養(yǎng)基平板檢測、血清學檢測技術、常規(guī)PCR檢測、巢式PCR檢測、雜交檢測。利用LPG培養(yǎng)基進行平板檢測，三天后即可呈現(xiàn)特異性的菌落特征。但是，這種方法往往會存在或出現(xiàn)大量的干擾菌落，限制了該方法的應用。我國的王中康等制備了該病菌的多克隆抗體，ELISA的檢測靈敏度較高，可以達到DNA點雜交的水平。然而在檢測過程中，ELISA檢測出現(xiàn)顯現(xiàn)了嚴重的局限性：某些感病莖組織檢測時結果為假陰性，有些木薯細菌性萎蔫病菌菌系不發(fā)生酶聯(lián)反應，另外一些黃單胞致病變種病菌如citri，euphorbiae，和vasculorum卻會發(fā)生交義反應。這些局限性不僅阻礙了ELISA檢測最終限值的研究，也使其應用受到了很大限制。

現(xiàn)代檢測技術越來越傾向于聚合酶鏈式反應法(PCR法)等分子檢測手段，油菜黃單胞菌木薯致病變種熒光PCR是一種以高分辨率熔解曲線分析為核心技術的高精度核酸檢測手段，該種技術無需后期圖像處理，所有檢測信息全部由熒光PCR儀自動采集完成，無需使用熒光探針即可完成基因、單堿基篩查，對于植物病原細菌一類病原微生物是一種理想的分子生物學檢測手段。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供油菜黃單胞菌木薯致病變種熒光PCR快速檢測，即一種能夠通過檢測油菜黃單胞菌木薯致病變種特異性片段來判斷檢測樣品中是否存在油菜黃單胞菌木薯致病變種的熒光引物。

本發(fā)明的熒光引物，包括：

1)序列為SEQ?ID?NO：1的上游引物和序列為SEQ?ID?NO：2的下游引物；

2)對1)中的引物對通過轉換、插入、缺失或5’添加基所形成的引物對，且引物對擴增的產(chǎn)物在嚴謹條件下與1)的引物的擴增產(chǎn)物發(fā)生雜交；

3)在1)或2)所描述的擴增片段上設計得到的引物對

本發(fā)明的油菜黃單胞菌木薯致病變種的熒光PCR快速檢測試劑盒，包括如下組分

1)2倍濃度的PCR體系預混合物；

2)上游引物和下游引物，濃度分別為10μmol/L；

3)20倍濃度的熒光染料；

4)DNA樣品/報告質粒，10μg/μL；

5)雙蒸水。

本發(fā)明根據(jù)油菜黃單胞菌木薯致病變種保守基因序列，通過分子生物學分析獲得了特異性引物，該保守基因序列為不同油菜黃單胞菌木薯致病變種菌系所共有，以保證從種的水平上檢測不同來源菌株的可靠性。另外，本發(fā)明的引物采用熒光標記，與普通PCR技術相比，不必用凝膠電泳方法來觀察，實現(xiàn)了檢測流程一體化封閉檢測。

具體實施方式

本發(fā)明根據(jù)油菜黃單胞菌木薯致病變種保守基因序列，通過分子生物學分析獲得了特異性引物，該引物包括：

1)序列為SEQ?ID?NO：1的上游引物和序列為SEQ?ID?NO：2的下游引物；

2)對1)中的引物對通過轉換、插入、缺失或5’添加基所形成的引物對，且引物對擴增的產(chǎn)物在嚴謹條件下與1)的引物的擴增產(chǎn)物發(fā)生雜交；

3)在1)或2)所描述的擴增片段上設計得到的引物對