[發(fā)明專利]霍亂弧菌ctxAB基因的質(zhì)粒克隆菌株以及制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310027484.4
• 申請日: 2013-01-24
• 公開（公告）號: CN103060253A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 麻麗丹;黃大亮;王殿夫;高世光;楊維儀
• 申請（專利權(quán)）人: 麻麗丹;黃大亮;王殿夫;高世光;楊維儀
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/19
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• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及霍亂弧菌全基因組DNA提取和ctxAB基因的質(zhì)粒克隆菌株、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

霍亂是由霍亂弧菌(Vibrio?cholerae)引起的烈性腸道傳染病，能引起霍亂流行的霍亂弧菌主要有兩種血清型，既O1群和O139群，霍亂弧菌的強致病作用主要是由其分泌的霍亂腸毒素導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉所致，因此準(zhǔn)確、快速的檢測霍亂弧菌，特別是產(chǎn)毒霍亂弧菌，對于預(yù)防霍亂弧菌感染具有重要意義。隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展，人們對細(xì)菌的侵襲素和毒力島等毒力基因認(rèn)識的不斷深入，細(xì)菌的檢測方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的一般表型特征鑒定深化為遺傳特征基因的鑒定。霍亂弧菌hlyA基因編碼具有溶血-溶細(xì)胞的蛋白，是弧菌屬高度保守的管家基因；霍亂弧菌rfb-O1基因和rfb-O139基因分別是O1群霍亂弧菌和O139群霍亂弧菌菌體抗原編碼基因，ctxAB基因是分泌霍亂腸毒素的毒力標(biāo)志，具有高度保守性。

由于霍亂弧菌的相關(guān)毒力基因、管家基因和功能基因總是成簇的位于染色體上，一般都在幾kb到幾十kb之間，難以用一般的PCR方法擴增并克隆這些基因。基因組文庫(genomic?library)是上世紀(jì)70年代末發(fā)展起來的一種分離基因組基因的新技術(shù)，它包含了基因組的全套遺傳信息(即全部基因)，人們可用相應(yīng)的基因探針從文庫中釣取出任一特定的基因片段加以研究。目前宏基因組學(xué)的應(yīng)用已成為研究已有基因和尋找新基因及其產(chǎn)物的一條新途徑，載體包括Cosmid、Fosmid和BAC等，平均插入片段大于40Kb，F(xiàn)osmid載體是一種替代Cosmid載體構(gòu)建大片段文庫的新載體，與BAC文庫構(gòu)建相比，F(xiàn)osmid文庫穩(wěn)定性、隨機性好、技術(shù)成熟、構(gòu)建更簡單快速。Fosmid載體由于插入了大腸埃希菌致育因子F^一因子，所以它在宿主菌中以單拷貝形式存在，穩(wěn)定性好。并且載體上有一個可誘導(dǎo)的oriV高拷貝復(fù)制起始點，需要時可誘導(dǎo)達(dá)到高拷貝(50個左右)。另外，F(xiàn)osmid文庫隨機性好，保證了每段DNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等。

為了防止“生物安全事故”而引發(fā)“公共衛(wèi)生事件”，國內(nèi)外均一致要求在PIII或PII生物安全實驗室內(nèi)對霍亂弧菌可疑樣品進(jìn)行檢測，通過構(gòu)建霍亂弧菌Fosmid文庫的目的就是要把霍亂弧菌染色體的全部基因克隆到易于培養(yǎng)的大腸桿菌中，篩選出霍亂弧菌hlyA基因、rfb-O1基因、rfb-O139基因和ctxAB基因單克隆菌株，霍亂弧菌克隆基因的宿主菌為大腸桿菌，不需要培養(yǎng)活的霍亂弧菌菌株，所以可以在PI生物安全實驗室進(jìn)行操作，有利于生物安全防護(hù)；同時也是研究霍亂弧菌的致病機理、潛伏機制、血清學(xué)變異機理、基因疫苗的制備和基因結(jié)構(gòu)及功能等分子生物學(xué)特性的前提；而且有利于進(jìn)行霍亂弧菌的基因功能的研究和滿足地方基層實驗室應(yīng)對霍亂疫情和疫源地疫情檢測時快速檢測霍亂弧菌的需要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供霍亂弧菌(Vibrio?cholerae)全基因組DNA提取方法和霍亂弧菌(Vibrio?cholerae)ctxAB基因的單克隆菌株，主要用于霍亂弧菌相應(yīng)基因檢測的陽性對照樣品，進(jìn)行質(zhì)量控制，也可用來考核檢驗人員的技術(shù)水平，以保證檢驗工作質(zhì)量；并且可以對不同的分析方法和不同的鑒定儀器進(jìn)行檢驗和校準(zhǔn)，使之具有準(zhǔn)確性、統(tǒng)一性、可比性和規(guī)范性。

本發(fā)明的一方面在于提供一種霍亂弧菌(Vibrio?cholerae)ctxAB基因的質(zhì)粒克隆菌株，其以大腸桿菌pCC1FOS為載體，轉(zhuǎn)化了霍亂弧菌的ctxAB基因的質(zhì)粒克隆菌株，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC?NO.7000。

本發(fā)明的另一方面在于提供一種霍亂弧菌ctxAB基因檢測試劑盒，其包括上文所述的保藏編號為CGMCC?NO.7000的質(zhì)粒克隆菌株作為陽性對照，及上下游引物與探針：SEQ?IDNO.10；SEQ?ID?NO.11；SEQ?ID?NO.12。

此外，試劑盒中還可以包括用于PCR擴增的2×PCR?Taqman?GEx酶預(yù)混液等試劑，本領(lǐng)域技術(shù)人員可依據(jù)試劑盒所應(yīng)用的PCR反應(yīng)類型，確定所需的緩沖液或擴增酶等試劑種類。

本發(fā)明的再一方面在于提供一種非疾病診斷目的霍亂弧菌ctxAB基因的多重PCR檢測方法，其利用上文所述霍亂弧菌ctxAB基因檢測試劑盒，對樣品DNA進(jìn)行多重PCR方法檢測。

對于上述技術(shù)方案中，優(yōu)選的情況下，所述的多重PCR方法檢測的條件為：

①反應(yīng)體系總體積為20μL，其中：