[發明專利]溴苯腈還原脫鹵酶基因簇bhbA2B2 及其應用

有效

• 申請號: 201310027045.3
• 申請日: 2013-01-24
• 公開（公告）號: CN103275992A
• 公開（公告）日: 2013-09-04
• 發明（設計）人: 蔣建東;李順鵬;陳凱
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/53;C12N9/02;C07K14/195;C12N15/74;C12N1/21;A62D3/02;C02F3/34;C02F3/00;B09C1/10;C12R1/01;A62D101/04;A62D101/26
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;傅婷婷

技術領域

本發明屬于應用環境微生物領域，涉及溴苯腈還原脫鹵酶基因簇bhbA2B2及其應用。?

背景技術

農藥的使用雖然提高了農業的生產效率及作物產量，但同時帶來嚴重的環境問題，造成生態失衡農產品品質下降，并直接影響人民的身體健康。溴苯腈(Bromoxynil)，化學名稱為3,5-二溴-4-羥基苯甲腈，屬有機氰化物，是一種具有傳導活性的選擇性苗后莖葉處理觸殺型除草劑。根據最新《農藥化學品》雜志通過對20世紀全球農藥市場情況的調查總結表明，在20世紀農藥革命的高潮中，應用最廣和對全球農業影響最大的二十二種農藥中，其中除草劑8種，而溴苯腈類就是這8種除草劑之一。溴苯腈于1963年被研究開發，1994年后逐步在我國推廣應用。目前我國已成為全球溴苯腈主要的生產國，年產大約8000-10000噸。由于溴苯腈使用量大、范圍廣泛，在作物、地下水和土壤中殘留，造成了嚴重的環境污染問題。隨著人類環保意識的增強，溴苯腈及其代謝產物污染的修復引起了人們的廣泛關注。微生物修復農藥污染的方法一種簡單、高效、廉價和無二次污染的方法，比化學方法、物理方法修復農藥污染具有很多優勢。微生物在農藥殘留的生物學解決途徑中有著獨特的作用。微生物降解修復農藥的本質是微生物產生的酶對農藥的降解作用，從微生物中提取的降解酶系來消除農藥殘留在國外已有成功的先例，降解酶的來源可以通過從降解菌中提取，也可以采用基因工程手段構建高效表達菌株來獲得。溴苯腈脫鹵酶基因的獲得在溴苯腈及其代謝產物污染的修復領域有巨大的應用潛力。同時可通過基因改造擴大脫鹵酶的作用底物范圍，廣泛應用于環境中鹵代芳香烴類污染物的脫鹵降解，保護環境。?

發明內容

本發明的目的是提供除草劑溴苯腈及其腈水解產物的還原脫鹵酶基因簇bhbA2B2。?

本發明的另一目的是提供除草劑溴苯腈及其腈水解產物的還原脫鹵酶基因簇編碼的蛋白質BhbA2B2。?

本發明的又一目的是提供該基因簇bhbA2B2的應用。?

本發明的目的可通過如下技術方案實現：?

溴苯腈還原脫鹵酶基因簇bhbA2B2，其核苷酸序列為SEQ?ID?NO.5，主要由細胞膜結合受體蛋白基因bhbB2和溴苯腈還原脫鹵酶基因bhbA2構成。?

一種溴苯腈還原脫鹵酶基因bhbA2，核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。該基因全長（從起始密碼子到終止密碼子）為3216bp，G+C含量為57.93%，編碼1071個氨基酸；其氨基酸序列為：SEQ?ID?NO.2。?

一種細胞膜結合受體蛋白基因bhbB2，核苷酸序列為SEQ?ID?NO.3。該基因全長（從起始密碼子到終止密碼子）為993bp，G+C含量為60.53%，編碼330個氨基酸，其氨基酸序列為：SEQ?ID?NO.4。?

含有本發明所述溴苯腈還原脫鹵酶基因簇的重組質粒pBBR1MCS2-bhbA2B2。?

溴苯腈還原脫鹵酶基因簇片段與BamHI和XbaI酶切好的pBBR1MCS2進行酶連獲得溴苯腈還原脫鹵酶基因簇的重組質粒pBBR1MCS2-bhbA2B2。?

含有本發明所述的重組質粒的重組微生物Comamonas?sp.2B-bhbA2B2。?

將酶連好的重組質粒pBBR1MCS2-bhbA2B2，通過三親接合轉化到受體菌株Comamonas?sp.2B中，獲得重組微生物Comamonas?sp.2B-bhbA2B2。?

上述溴苯腈還原脫鹵酶基因簇、含有該基因簇的重組質粒及重組微生物可以在農作物、土壤、水體的溴苯腈及其腈水解產物殘留去除方面得到應用。?

其所涉及的溴苯腈還原脫鹵酶蛋白和細胞膜結合受體蛋白可以在農作物、土壤、水體的溴苯腈及其腈水解產物殘留去除方面應用。?

有益效果?

1.從叢毛單胞菌菌株Comamonas?sp.7D-2（從溴苯腈污染土壤中分離篩選獲得的溴苯腈降解菌株，其16S?rRNA基因序列的GenBank登錄號為JX455142，專利菌種保藏編號為CGMCC?No.6931）中提取出溴苯腈降解野生型大質粒，并通過454高通量測序獲得溴苯腈還原脫鹵酶基因簇bhbA2B2。?