[發明專利]一種醛脫氫酶及其制備方法

有效

• 申請號: 201310026030.5
• 申請日: 2013-01-23
• 公開（公告）號: CN103114056A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 曾潤穎;劉洋;丁志新
• 申請（專利權）人: 國家海洋局第三海洋研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/53;C12N9/02;C12N15/70;C12R1/01
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及一種醛脫氫酶，尤其是涉及來源于深海的太平洋火色桿菌（Flammeovirga?Pacifica）H2的新型醛脫氫酶基因，及其重組表達所得到的醛脫氫酶及其制備方法。

背景技術

醛脫氫酶（Aldehyde?dehydrogenase）（EC1.21.3）是能夠催化內源和外源醛氧化的NAD(P)+依賴型的酶超家族。迄今為止，已經從人類發現了19種醛脫氫酶基因，這些基因參與內生和外生乙醛的代謝(Crabb,Matsumoto,Chang,&You,2004)。研究者發現，醛脫氫酶在植物及微生物抗環境壓力（干旱，高鹽）方面也具有重要的作用(Huang?et?al.,2008;Li,Gao,Yu,Wang,&An,2003)，Yang等(Yang,Zhang,Wang,Wood,&Zhang,2012)將齒肋赤蘚中的醛脫氫酶基因轉化到大腸桿菌中，轉化菌得到重組菌也具有抗干旱和高鹽的能力。Tomohisa?kato等(Kato,Miyanaga,Kanaya,&Morikawa,2010)從Geobacillus?thermoleovorans?B23得到了能夠降解長鏈鏈烷的醛脫氫酶基因，Jyumpei?Kokayashi等從Rhodobacter?sphaeroides可以在低濃度醋酸鹽中提高氫產量的醛脫氫酶。在專利方面，不同來源的醛脫氫酶基因已經被克隆、測序和表達，主要應用于利用L-山梨糖酮生產維生素C或2-KGA，解酒的保健品等。

發明內容

本發明的第一目的是提供一種新型醛脫氫酶基因fwaldh。

本發明的第二目的是提供一種由所述醛脫氫酶基因fwaldh編碼的醛脫氫酶Fwaldh。

本發明的第三目的是提供醛脫氫酶Fwaldh的制備方法。

所述醛脫氫酶Fwaldh的生產菌株為太平洋火色桿菌（Flammeovirga?Pacifica）H2，該菌株已于2012年6月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為：CCTCC?NO:M2012229，地址為武漢，武漢大學，郵編430072。

所述新型醛脫氫酶基因fwaldh的序列（SEQ?ID?No.1）如下：

SEQ?ID?No.1的信息：

1)名稱：Flammeovirga?Pacifica醛脫氫酶基因；

2)分子類型：DNA；

3)序列特征：

A)長度：1440bp；

B)類型：核酸；

C)鏈性：雙鏈；

D)拓撲結構：線性。

所述醛脫氫酶基因fwaldh編碼的醛脫氫酶Fwaldh的氨基酸序列（SEQ?ID?No.2）如下：

SEQ?ID?No.2的信息：

1)名稱：Flammeovirga?Pacifica醛脫氫酶；

2)分子類型：蛋白質；

3)序列特征：

A)長度：479aa；

B)類型：氨基酸。

所述醛脫氫酶Fwaldh的制備方法包括以下步驟：

1）克隆所述醛脫氫酶基因fwaldh；

2）將所述醛脫氫酶基因fwaldh插入表達載體，構建攜帶所述醛脫氫酶基因fwaldh的重組表達載體；

3）將所述重組表達載體轉化到E.coli?BL21中；

4）選取轉化后E.coli?BL21中的陽性克隆于培養基中進行發酵培養；

5）離心收集發酵后的E.coli?BL21細胞，重懸所述E.coli?BL21細胞于裂解緩沖液中進行裂解；

6）將步驟5）中裂解后的懸液進行離心，收集上清液；

7）將上清液與Ni-NTA?Agarose混勻，按照純化試劑盒說明書進行純化，即得所述醛脫氫酶Fwaldh。

在步驟2）中，所述表達載體可為pET-His載體。