[發明專利]R112W型酮胺氧化酶及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201310025988.2
• 申請日: 2013-01-22
• 公開（公告）號: CN103937763A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 林章凜;錢昱;鄭靜
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種R112W型酮胺氧化酶及其編碼基因和應用。

背景技術

美拉德反應，又稱為非酶催化糖基化反應，是一類自然界常見的反應。還原糖（最常見的是葡萄糖）與氨基化合物在常溫或是高溫下發生反應，生成Amadori產物，并進一步交聯得到高級糖基化終產物以及類黑素類物質。該反應在食品的加工和儲存過程中發揮著重要的作用，對食品的色澤，風味和營養成分等都有重要的影響。近年來的研究發現，在生物體內也存在美拉德反應，反應的產物與人類的衰老，糖尿病并發癥等病癥有密切的關系，從而受到廣泛的關注。

酮胺氧化酶（fructosyl?amine?oxidases，縮寫為FAOXs）是一類存在于微生物體內的去糖基化酶，可以催化降解Amadori產物，通常生成氨基化合物、葡糖醛酮和過氧化氫。在該酶發現之初，最先應用于糖尿病的檢測，目前基于FAOXs的檢測已經成為糖尿病檢測和診斷中的一項“金指標”。同時，這類蛋白酶在食品質量控制，洗滌劑添加劑以及糖尿病治療等方面也展現出了巨大的應用前景。但是，目前已知的酮胺氧化酶都只能作用于小分子底物，如糖基化氨基酸或是糖基化二肽，這也極大地限制了該酶的應用。

來源于煙曲霉Aspergillusfumiga?tus的酮胺氧化酶Amadoriase?II于1997年首次被分離，可以直接作用于一種較大分子量的底物糖基化金剛烷胺（fructosyl-adamantanamine）。該酶的晶體結構在2008年被報道，晶體結構顯示，在該酶表面有兩個柔性的Loop區域（氨基酸殘基序列自N末端第58-66位的殘基區域以及第110-119位的殘基區域），位于底物通道入口附近，在底物結合過程起到重要作用。

發明內容

本發明的目的是提供一種R112W型酮胺氧化酶及其編碼基因和應用。

本發明提供的R112W型酮胺氧化酶，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列3自N末端第1至438位氨基酸殘基組成的蛋白質；

（b）由序列表中序列3所示的氨基酸殘基組成的蛋白質。

編碼所述R112W型酮胺氧化酶的基因也屬于本發明的保護范圍。

所述基因為可如下1）或2）或3）或4）或5）的DNA分子：

1）編碼區如序列表中序列4自5’末端第1至1314位核苷酸所示的DNA分子；

2）編碼區如序列表中序列4自5’末端第1至1344位核苷酸所示的DNA分子；

3）編碼區如序列表中序列4所示的DNA分子；

4）在嚴格條件下與1）或2）或3限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子；

5）與1）或2）或3限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質的DNA分子。

上述嚴格條件可為在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜一次。

含有所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬于本發明的保護范圍。

可用現有的表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構建重組表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨使用或與其它啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。

所述的重組載體具體可為將所述基因插入pEAS-1a質粒的多克隆位點得到的重組質粒。

所述重組菌具體可為將所述重組載體導入大腸桿菌BL21得到的重組菌。

本發明還保護所述蛋白質在制備酮胺氧化酶中的應用。

本發明還保護所述蛋白質在降解糖基化底物中的應用。所述糖基化底物具體可為糖基化多聚賴氨酸或糖基化金剛烷胺。

本發明還保護所述重組菌在生產所述蛋白質中的應用。

應用所述重組菌制備所述蛋白質時，可采用如下方法：將所述重組菌進行發酵，收集發酵產物，發酵產物中即含有所述蛋白質。

所述方法具體包括如下步驟：